為防止海水魚養殖及運輸貯藏過程中微生物過度繁殖導致食物腐敗變質，常使用四環素和喹諾酮兩類藥物。相關國家標準規定，魚類皮和肉中恩諾沙星（以恩諾沙星與環丙沙星含量合計）、四環素、土霉素、金霉素及多西環素的最大殘留限量分別為100，200，200，200，100μg·kg−1，氧氟沙星、諾氟沙星及培氟沙星均不得使用。由于部分養殖者對相關藥物的非法濫用，養殖海水魚中這兩類抗生素藥物的檢出率居高不下，由此帶來的食品安全問題日益突出，不僅對人體健康產生直/間接危害，而且導致細菌嚴重耐藥進而對生態系統產生毒害。因此，開發可靠、快速、高通量、高精度、易操作的監測海水魚中這兩類藥物殘留量的分析方法尤為重要。檢測關鍵點主要集中在前處理方法和測定方法的選擇上。這兩類藥物殘留的樣品前處理方法主要有液液萃取法、固相萃取法及 QuEChERS等。相較傳統的液液萃取法及固相萃取法，QuEChERS精密度和準確度更好，分析更快，有機溶劑用量更少，操作更簡單等，適用于大批量樣品分析。但是QuEChERS無法完全消除基質干擾，對定量結果存在一定影響。因此，本工作優化了QuEChERS前處理條件，選擇同位素內標法定量，提出了一種基于Cleanert LipoNo凈化管的操作簡單、快速、高效、準確、可靠的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法，用于測定大批量海水魚樣品中4種四環素類藥物及5種喹諾酮類藥物的殘留量。

1、試驗方法

    稱取均質好的樣品于離心管中，加入混合內標工作液，渦旋混勻。加入Na2EDTA溶液，渦旋后加入乙腈，渦旋，超聲后離心。取全部上清液，加至Cleanert LipoNo凈化管，振搖后靜置。取全部上清液，氮吹至干，用初始流動相復溶，過有機濾膜，濾液收集至進樣瓶，按照儀器工作條件測定。

2、結果與討論

2.1 色譜條件的選擇

     試驗比較了分別以水-乙腈、5mmol·L−1乙酸銨溶液-乙腈、0.1%甲酸溶液-乙腈體系作流動相時目標物的峰形及響應情況，根據試驗結果，選擇0.1%甲酸溶液-乙腈體系作流動相。在優化的色譜條件下，加標空白海水魚基質溶液的提取離子色譜圖見圖1。

     由圖1可知，9種藥物及2種內標的色譜峰峰形對稱、尖銳，保留時間為 3.72~5.03min，滿足定量分析要求。

2.2 前處理條件的選擇

2.2.1 提取條件

     適用于QuEChERS提取的溶劑主要有甲醇及乙腈，相較甲醇，乙腈可以有效沉淀蛋白，且對糖類和脂肪的溶解程度更低，因此試驗選擇采用乙腈提取樣品中的目標物。考慮到四環素類藥物容易與金屬離子、蛋白質等發生螯合作用，提取難度較高，試驗進一步優化提取溶劑，確定采用0.1mol·L−1Na2EDTA溶液+乙腈提取，該溶劑組合有利于沉淀蛋白，并能將藥物從生物組織中釋放出來，充分溶解在乙腈中。為確保提取充分，試驗比較了分別對加標空白基質（加標量5μg·kg−1）提取1，2，3次時各目標物的回收率，結果見圖2。

    由圖2可知，不同提取次數下回收率均在90.0%~110%內。為節省分析時間，試驗選擇只提取1次。

2.2.2 凈化方法

     在日常監督抽樣檢測中發現，液液萃取法對試驗人員的操作能力要求較高，且耗費時間過長；固相萃取法需要專門的固相萃取裝置，凈化過程包括固相萃取柱活化以及樣品提取液上樣、淋洗、洗脫、收集等步驟，操作繁雜、耗時較長，且容易發生固相萃取柱堵塞等問題。因此，試驗選擇采用QuEChERS凈化樣品，并比較了分別采用凈化材料Cleanert LipoNo、C18+N-丙基乙二胺（PSA）（質量比 1∶1）、氧化鋯吸附脂類等非極性干擾物（用量均為1g）時加標空白基質（加標量5μg·kg−1）中各目標物的基質效應（ME）值（外標法所得ME值絕對值，分別采用空白基質溶液和初始流動相配制混合標準溶液系列并制作標準曲線，以前后二者標準曲線斜率比和 1 的差值的絕對值計算），結果見圖3。

    由圖3可知，Cleanert LipoNo所 得ME值絕對值更小，說明其凈化效果更好，這是由于Cleanert LipoNo是一種表面修飾了大量大顆粒長碳鏈的除脂材料，可針對性地吸附脂肪等非極性干擾物，且操作簡單，試驗人員只需將提取液轉移進填充有Cleanert LipoNo的凈化管中，振搖后靜置分層，2min即完成全部凈化工作，操作簡單、快速，無需專門凈化設備，且成本較固相萃取法更低。

2.3 基質效應及消除

     采用超高效液相色譜-串聯質譜法分析動物源性食品時，由于樣品基質往往會對定量結果產生嚴重影響，因此需要對基質效應進行評估。參考文獻計算ME值，當ME值絕對值不大于10%時，基質效應可以忽略；當ME值絕對值在 [10%，50%）內時，存在中等基質增強或抑制效應；當ME值絕對值大于50%時，存在強基質增強或抑制效應，對定量結果影響較大。當存在中等或強基質效應時，需要優化檢測方法，將ME值絕對值控制在10%以內。目前消除基質效應的方法主要有空白基質匹配標準曲線法和內標法。在實際檢測中，樣品基質種類多樣，不同基質對同一目標物產生的基質效應差異較大，若每種基質都用來制作空白基質匹配標準曲線，則所需空白基質數量龐大，經濟及操作上均難以實現。同位素內標法不僅準確度高、操作簡單，且無需制作空白基質匹配標準曲線；在同一類型藥物中選取1~2種同位素內標直接進行內標法定量分析，既兼顧了經濟性又能確保方法的準確度。綜合考慮，試驗選擇采用四環素-d6作為四環素類藥物的同位素內標，恩諾沙星-d5作為喹諾酮類藥物的同位素內標，并以市場銷售量較高的6種空白海水魚基質（黃花魚、黃翅魚、帶魚、海鱸魚、金線魚和鯧魚，其中黃花魚及黃翅魚中目標物檢出率較高）為待測對象，考察了分別采用內標法與外標法測定時各目標物的ME值，所得結果見圖4。

    由圖4可知：采用外標法定量時，兩類藥物ME值絕對值在 [10%，50%) 內，均顯示為基質抑制效應；采用內標法定量時，兩類藥物ME值絕對值均小于10%，說明內標法能有效消除基質效應。

2.4 方法學考察

2.4.1 標準曲線、檢出限和測定下限

     分別取混合標準工作液及混合內標工作液適量，用初始流動相稀釋，配制成含內標50μg·L−1，各目標物5.00，10.0，25.0，50.0，75.0，125μg·L−1的混合標準溶液系列，按照儀器工作條件測定。以各目標物質量濃度與內標質量濃度的比值為橫坐標，對應的目標物的定量離子色譜峰面積與對應內標子離子色譜峰面積的比值為縱坐標繪制標準曲線，所得各標準曲線的線性范圍均為5.00~125μg·L−1，其他線性參數見表1。

表1 線性參數

     在空白海水魚基質中加入標準溶液，制備一系列低濃度加標水平的海水魚樣品（加標量1.00，2.00，5.00，10.00μg·kg−1），按照試驗方法測定。以信噪比接近3，10的加標量作檢出限和測定下限，檢出限和測定下限分別為2.00，5.00μg·kg−1。

2.4.2 精密度和回收試驗

     選取不合格率較高的空白黃花魚基質，在1，2，10倍測定下限水平下各進行6次平行加標回收試驗，計算回收率和測定值的相對標準偏差（RSD），結果見表2。

表2 精密度和回收試驗結果 (n=6)

     由表2可知，9種藥物的回收率為91.3%~110%，測定值的RSD為 3.4%~11%，滿足實際檢測準確度和精密度要求。

2.5 樣品分析

     按照試驗方法分析2022— 2023年實驗室監督抽樣中留存的200批海水魚樣品，檢出結果與當年實驗室監督抽樣所用國家標準方法的進行比對。結果顯示：四環素類藥物均未檢出；在41批樣品中檢出了喹諾酮類藥物，其中41批樣品檢出了恩諾沙星，36批樣品同時檢出了環丙沙星，6批樣品中恩諾沙星和環丙沙星總檢出量超過國家標準規定（100μg·kg−1），比對結果如表3所示。

表3 方法對比結果

     由表3可知，200批海水魚樣品的檢出結果與當年監督抽樣檢驗結果基本一致，但是本方法所需前處理時間及投入人員數大大減少，說明本方法操作更為簡便、快速，且結果穩定可靠。

3、試驗結論

    研究人員采用基于Cleanert LipoNo凈化管的QuEChERS-超高效液相色譜-串聯質譜法測定海水魚樣品中四環素和喹諾酮類藥物的含量，大大

     縮短了樣品前處理和儀器運行時間，同時保證了較高的準確度及精密度，適用于大批量海水魚樣品中抗生素殘留的快速、高效、準確測定。后續研究可增加藥物種類及樣品種類，一次性實現對多基質中多種類藥物的快速定量分析，進而為政府大規模開展食用農產品監督抽樣及風險監測提供有利技術支持。

作者：蔡振世，許琨琨，盧文斌

單位：泉州市食品藥品檢驗所

來源：《理化檢驗-化學分冊》2024年第10期