摘要

目的

為國內細菌內毒素檢測、研究和藥物警戒工作提供參考。

方法

參考《美國藥典》1085 細菌內毒素檢查法應用指導原則和《中國藥典》 9251 細菌內毒素檢查法應用指導原則，對中國與美國內毒素標準物質管理、質量管理的異同及指導原則中容易誤讀的要點等相關內容進行介紹和解讀。

結果

中國與美國細菌內毒素檢查法應用指導原則均在2020 年被首次收載，在背景、檢測、工作標準品標定、質量管理、限度計算、替代方法等方面給予了詳細指導和論述。

結論

中國與美國內毒素檢查法應用指導原則作為細菌內毒素檢測領域的權威指導原則，為內毒素實驗室檢測人員及《中國藥典》修訂提供幫助與啟示，并將在實踐中不斷調整和完善。

關鍵詞

細菌內毒素；中國藥典；美國藥典；解讀

《中華人民共和國藥典》（2020 年版）（簡稱“《中國藥典》”）收載了 9251 細菌內毒素檢查法應用指導原則。同年，《美國藥典》（47 版）（簡稱“《美國藥典》”）也收載了1085 細菌內毒素檢查法應用指導原則。表明細菌內毒素檢查法在世界范圍內經過多年發展，為了應對新的情況，均需要進行新的官方解讀和指導。中國與美國藥典中的內毒素檢查法指導原則具有多項不同，本研究參考《美國藥典》1085 細菌內毒素檢查法應用指導原則和《中國藥典》9251 細菌內毒素檢查法應用指導原則，對中國與美國內毒素標準物質管理、質量管理的異同，指導原則中易誤讀的要點解讀等相關內容進行介紹和探討，解讀異同產生的背景和原因，為內毒素檢測從業者提供參考。

1、中國與美國藥典內毒素檢查法指導原則主要內容差異

《美國藥典》1085 分為背景、預備性試驗、方法適用性、日常檢測、替代方法、詞匯表、參考文獻7 個項目來進行介紹 ，與《中國藥典》9251 中的內容部分重疊（表 1）。

2、中國與美國藥典指導原則的解讀

中國與美國內毒素檢查法指導原則體例不同，因《美國藥典》相較《中國藥典》對應條目更多，因此本文按照《美國藥典》的體例逐一展開，先介紹《美國藥典》的內容，涉及到《中國藥典》內容時，在本條目中對比中國與美國藥典進行介紹。

2.1 背景知識

含有熱原的藥物或醫療器械進入哺乳動物的血液或腦脊液后，會引起發燒等熱原反應。進入體內的方式包括注射、輸液，植入等形式。盡管某些生物制劑、疫苗以及細胞和基因療法自身的藥理活性可能會引起患者發熱，但注射劑和醫療器械生產中最主要和最易致熱的污染物是細菌內毒素，其為革蘭陰性細菌（gram-negative bacteria, GNB）細胞壁的組成部分。

術語“細菌內毒素”或“內毒素”是指GNB外細胞膜的復雜成分。具有生物活性的脂多糖（lipopolysaccharide, LPS），包括各種蛋白質、磷脂和脂蛋白。LPS分子的疏水脂質A部分嵌入膜中，親水多糖部分暴露于細胞周圍的外部環境。內毒素可能會在GNB 死亡后在細胞壁片段中保持活性，因此供試品可能是無菌的，但仍可能檢測出內毒素。注射劑（包括生物產品）或醫療設備中存在細菌內毒素時，表明GNB的生長發生在產品制造過程中的某個時間點。藥品生產過程中，污染內毒素的方式有多種，可能源自藥物成分（包括水，原料，賦形劑，包裝材料，清潔或存儲的制造設備），也可能由于控制措施失效 。

當前的中國和美國的內毒素標準物質分為參考標準品（endotoxin reference standard, RSE，中國稱為國家標準品）和商業制備的對照標準內毒素（Control standard Endotoxin, CSE，中國稱為“工作標準品”），通常是通過Westphal熱酚法從 GNB 細胞膜中提取出來，并進行純化以去除其他的細胞膜成分 。此外，這些純化的制劑通常還與穩定劑 一起配制。但污染藥品的是自然內毒素，不會是使用 Westphal 或其他提取方法制備的純品 LPS。因為自然內毒素本質上不以這種純品形式存在。由于內毒素來源和制備方式的差異，內毒素標準品可能與天然來源的內毒素有不同的反應。即在一些情況下，標準品中的內毒素和自然內毒素的活性不完全相同 。這些標準品在某些樣品（藥物，生物制品或醫療器械）回收率實驗中可能無法代表天然內毒素。

盡管細菌內毒素檢查法是通則方法，但仍然需要驗證相關內容：計算或指定被測物質的內毒素指標或限值，以及計算最大有效稀釋倍數（maximum valid dilution, MVD）；然后試驗證明可以在不超過MVD的稀釋下供試品陽性對照（positive product control, PPC）成立。一旦證明了檢測的適用性，實驗室可以根據適用性研究中所述的計算和樣品制備條件進行常規測試。對條件的更改（如鱟試劑和/或內毒素的來源、配方或生成工藝的更改等）必須進行更改控制，并可能需要重復進行適用性研究 。

2.2 預備性試驗

《美國藥典》在預備性試驗中主要包括2 部分內容：第一部分，有關工作標準品的標定，分為使用RSE 對CSE的校準、使用凝膠法確定 CSE效價、使用定量的動態法和終點法確定 CSE效價、液體CSE的活性測定4個部分內容；第二部分，關于細菌內毒素檢測的質量管理，分為試驗人員資質、設備和儀器的校準與檢定、實驗室環境條件 3 項內容。

《中國藥典》中目前沒有收載有關標準品標定內容。原因在于，我國與美國對內毒素工作標準品的管理和使用有較大差別。RSE由美國食品藥品監督管理局（US Food and Drug Administration, FDA）生產并組織協作標定給賦值，CSE 由鱟試劑生產廠家生產并根據 RSE 來標定 CSE。我國國家標準品和工作標準品由國務院藥品監督管理部門依法設立的藥品檢驗機構生產并組織協作標定賦值。一般藥品質量控制者在使用鱟試劑時，如果使用的是我國的鱟試劑，則應選擇使用中國的標準物質。如果使用的是進口鱟試劑，則應按其要求使用對應的內毒素標準物質，不應交叉使用。

關于內毒素檢測方面的質量管理內容，在我國符合實驗室認可的相關規定即可。本實驗室的研究人員對內毒素檢測的質量管理內容已進行過較為詳細的介紹，可供相關檢測人員參考。

2.3 方法適用性

《美國藥典》在本部分共有 3 部分內容，包括細菌內毒素限值的確定、MVD 和干擾的排除。在限度的確定方面，《美國藥典》基本囊括了所有內容，包括注射用藥品、眼部用產品、復合無菌制劑、活性底物和賦形劑、藥械組合產品以及醫療器械等。《中國藥典》只對注射用藥品的限值確定做了相關要求，但對于多種規格的注射劑以及原料藥制定內毒素限值的制定方面給予了明確指導。《美國藥典》在MVD 的介紹方面提出，當產品在 MVD 顯示陽性時，表明其不符合內毒素限量要求，在這種情況下，可以使用超過 MVD 的稀釋倍數來進行檢驗。并建議實驗室可通過稀釋至陰性（凝膠法）或到達標準曲線上的有效讀數（定量法）的方式來確定產品中細菌內毒素的總含量。在有關干擾因素方面，《美國藥典》比較詳細地介紹了一些常見的干擾因素產生的原因和排除的方法。

《中國藥典》在“供試品的前處理方法”中重點介紹了目前細菌內毒素檢測的一些難題，如微球脂質體等采用包合技術制備的特殊樣品，及難溶性的注射用原料藥和輔料，應采取特殊的前處理將微球和脂質體以及難溶性樣品被包裹的內毒素釋放出來，再進行檢測，并且針對不同類型的樣品給予了不同的建議 。這部分內容是國內針對各類情況進行總結概括提出的指導，具有很好的可操作性。《美國藥典》對此沒有敘述。

2.4 日常檢測

2.4.1 采樣

《美國藥典》對于樣品的采集要求給予了充分的介紹。包括對取樣所有材料（勺子、移液管、瓶）的質地要求，采用必須采取的預防措施，生產中循環水系統中如何取樣，粉狀和顆粒狀固體尤其是對于高黏度材料如何取樣和應注意的問題等 。《中國藥典》對采樣部分沒有特別介紹。

2.4.2 合并

《美國藥典》對于樣品的檢驗，允許進行“合并”檢驗。術語“合并”是指制備一個混合樣品制劑，其中包括來自相同批次或不同批次的等分試樣。對于在藥物產品上進行細菌內毒素檢測分析的實驗室而言，合并是可接受的選擇。但是，合并有許多缺點，最明顯的是，其會稀釋任何一個單位中的內毒素，從而可能掩蓋了內毒素含量。因此應盡量設計科學合理的抽樣計劃。如果合并檢測，則必須調整 MVD。調整后的 MVD 是通過將原始計算出的MVD 除以合并的樣品數來計算的。例如若小劑量腸胃外藥物的 MVD 為 240，而制造商選擇合并 3 小瓶樣品進行測試，則調整后的 MVD 為 240/3，即 80。這種 MVD 的縮小有效地降低了產品的內毒素限量因子來補償合并。雖然合并可能會使鱟試劑的使用量減少而節省成本，但是合并時需要注意：合并可能會掩蓋各個樣品單位之間內毒素含量的任何不均勻性，而不均一污染的信息可能在排除故障或調查中很有價值。應當始終使用無菌技術進行等分試樣樣品的合并，并在取出等分試樣之前與各個單元劇烈混合。如果出現超標（out-of-specification, OOS）測試結果，應保留帶有剩余產品的原始容器以進行調查。建議使用無熱原的注射器通過消毒的橡膠塞子取出等分試樣，以便在隨后進行的調查測試時保持每個容器的完整性。調整后的 MVD 的概念不適用于醫療器械。藥品的任何抽樣方案都必須代表批次的開始、中間和結束。如果懷疑在制造過程中有可能存在內毒素的污染，則應增加取樣。

如果在調整后的 MVD下產品的干擾不能排除，則應單獨測試樣品。計算出 MVD 較低的產品，或無法保證所取等分試樣均一的懸浮液，可能不是合并的良好選擇。合并不適用于過程中的樣本，尤其是代表制造不同階段的樣本。

雖然合并檢測內毒素的方法在《美國藥典》的框架下是一種可被接受的方案，但在我國的質量控制實踐中則較少被提及。目前國內的內毒素質量標準中，也沒有采用多支樣品的情況。因此《中國藥典》中沒有關于合并檢測的相關內容。

2.4.3 超標結果和重新測試注意事項

應明確無效試驗和有效試驗的概念。由于系統適應性參數（如陰性對照，PPC，凝膠法中的鱟試劑靈敏度復核試驗或光度測定法中的標準曲線的可靠性試驗）的情況會影響測試結果的準確性。系統適應性參數未按預期發揮作用的試驗被稱為無效試驗，應該跟蹤調查無效試驗并努力尋找可能需要采取糾正措施的模式和趨勢。系統適用性參數全部成立，并經過全面的調查排查，不存在任何的異常情況，此時的結果則被認為是有效的。真正的 OOS 結果僅在執行了有效的測定并產生超出規格的結果時存在。無效的測試不是OOS結果。《美國藥典》還對OOS調查的內容進行了描述。《中國藥典》中沒有專門關于細菌內毒素檢測 OOS 結果的規定。

本實驗室針對細菌內毒素的OOS進行了較為詳盡的研究，歸納了OOS產生的原因和解決方案 。

2.4.4 標準曲線控制

在終點濁度法和終點顯色法中，通過評估濁度（色度）強度和標準濃度之間的直接關系，所建立的標準曲線具有正斜率，曲線的相關系數必須≥ 0.980。在動態濁度法和動態顯色法中，通過繪制反應時間的對數值和標準內毒素濃度的對數值的來繪制標準曲線，數據的這種轉換會導致標準曲線的斜率為負，并且相關系數必須≤ -0.980。綜上，藥典對光度測定法中的線性要求是 | r | ≥ 0.980。并要求用 3 個有效數字表示，最后一個“0”很重要；在一個控制良好的實驗室中，相關系數通常大于 0.980。所有標準曲線都有一個對應的線性方程 y = mx + b，其中 m 是標準曲線回歸線的斜率，b 是 y 軸截距。由于數據進行了對數轉化，因此定量分析的標準曲線可能對達限時間（onset time）的微小變化非常敏感。

測試結果的準確性取決于標準曲線的準確性。因此，對每個批次的鱟試劑的達限時間進行監控十分必要 。如分析人員可以在標準液的稀釋中產生2倍或10倍的稀釋誤差，但仍然可以生成滿足 | r | 要求的線性標準曲線≥ 0.980。僅通過查看相關系數難以注意到稀釋誤差，應觀察標準品的達限時間與稀釋準確的標準系列相比。稀釋誤差也將反映在 y 截距生成的值中。斜率的變化也會影響測試數據的準確性。建議在對分析人員進行定量分析的培訓中，強調可變性（CV）對測試結果準確性的影響。

《中國藥典》關于標準曲線給出的操作細節方面的信息較《美國藥典》少，但要求方面與《美國藥典》一致。

2.5 替代方法

在通則細菌內毒素檢查法中列出的用于檢測細菌內毒素的方法（凝膠限度法、凝膠半定量法、動態顯色法、終點顯色法、動態濁度法、終點濁度法）是法定方法。但實驗室可以選擇使用內毒素檢查法中未列出的測定方法。如果做出這樣的選擇，則必須充分驗證用于檢測細菌內毒素的替代方法，以確保使用的替代方法等同于或優于現有的內毒素檢查法，并最終由相應的監管機構批準。可以在《美國藥典》1223 替代微生物方法的驗證和《美國藥典》1225 藥典程序的驗證中找到有關如何進行替代方法的驗證 。

《中國藥典》關于替代方法的要求與《美國藥典》類似，《中國藥典》規定如果使用 1143 細菌內毒素檢查法以外的方法，應遵循藥典凡例的要求進行驗證，即可作為現有藥典方法的補充方法使用。本實驗室針對重組 C 因子和微量凝膠法為替代方法分別進行了方法學和品種適用性研究，并針對替代方法的應用進行了詳細解讀 。

2.6 產品內毒素檢查法的建立

《中國藥典》對產品的內毒素檢查法的建立有專門的規定，此部分內容《美國藥典》中沒有相關規定。《中國藥典》規定為了驗證樣品和不同廠家鱟試劑反應的一致性：應使用 2 個生產廠家的鱟試劑對至少 3 批樣品進行干擾試驗。并且明確建議了不宜建立細菌內毒素檢查項的情況：無法排除供試品對細菌內毒素檢查的干擾作用或只能使用最高靈敏度鱟試劑（凝膠法 0.03 EU·mL-1，光度法 0.001 EU·mL-1）。這2方面規定充分考慮了中國的鱟試劑管理、生產和使用的特點，具有較強的實際意義。

3、內毒素檢查法指導原則的意義

藥典中的檢測方法眾多，專門為檢測方法的應用建立的指導原則并不多見。細菌內毒素檢查法是藥品安全性的重要檢查項目，中國與美國等國家藥典中專門收載細菌內毒素檢查法的指導原則體現出該方法在藥品質量控制中的重要地位。同時也說明該方法在應用過程中需要特殊注意的方面較多。無論是國內外內毒素檢測應用方面的研究仍然是研究熱點。

4、結論

4.1《中國藥典》在方法的選擇、供試品的前處理方法、產品細菌內毒素檢查法建立給予了較多指導

隨著內毒素檢查法在中國的發展，出現了以下 5個主要問題，包括：更多種類的樣品需要制定內毒素限度；伴隨光度法鱟試劑的國產化，國內用戶在試驗方法上可供原則也更加寬泛；新型制劑、難溶性樣品內毒素檢測新問題的出現；國內多廠家鱟試劑差異仍然存在；替代方法的出現。《中國藥典》內毒素檢查法針對國內的發展階段，有針對性地對上述 5 個方面給予明確指導和要求。

4.2《美國藥典》在生產過程中、實驗細節、質量管理給予了較多指導

細菌內毒素檢查法作為一種生物檢定而非理化檢測方法，《美國藥典》為了使得更多從業者正確理解內毒素檢查法特性，在指導原則中介紹了大量的內毒素檢測相關知識和信息，從細菌內毒素的基本性質到實驗中的細節信息，再到生產和檢驗過程中的質量管理。對于新的從業人員了解，掌握細菌內毒素十分有益。

4.3 中國與美國內毒素檢查法指導原則各有特色

《美國藥典》給予的檢測相關信息較多；《中國藥典》給予的明確要求較多。在實際應用中，對于中國的藥品從業者，了解相關知識和信息后，有利于對內毒素檢查法加深理解，并可同時遵照《中國藥典》的要求執行。

綜上所述，中國與美國細菌內毒素檢查法應用指導原則均為收載于藥典中的指導原則，根據中國與美國實際情況而具有不同的側重點，《中國藥典》中的指導原則傾向于在檢驗應用方面；而《美國藥典》的指導原則傾向于生產過程方面。中國與美國藥典收錄內毒素檢查法應用指導原則，為內毒素檢測工作者提供了權威的技術指導原則，更加有力地保障藥品的質量安全。