siRNA轉(zhuǎn)染后一定時間內(nèi)，需采用基本方法驗證其轉(zhuǎn)染效率，常見驗證方式包括Western blot、RT-PCR、流式細胞術(shù)及ELISA等，對于含有熒光的質(zhì)粒，也可采用熒光顯微鏡直接觀察的方式來大致確定轉(zhuǎn)染效率。一般來說，由于轉(zhuǎn)染后的細胞常用于功能學(xué)實驗，因此應(yīng)該選用可以確定其轉(zhuǎn)染效率的方法，本文主要分享在mRNA水平或蛋白水平上驗證基因沉默的效果。

收細胞時間由轉(zhuǎn)染方式及細胞狀態(tài)來決定，一般至少為轉(zhuǎn)染后48h，上限一般為3-5天。

一、mRNA水平——RT-PCR驗證

1.提取轉(zhuǎn)染后的細胞的RNA并逆轉(zhuǎn)錄獲取相應(yīng)的cDNA后，配制SYBR、RNase-free water和cDNA的混合液，按照SYBR：RNase-free water為3：4的比例配制，cDNA按照一個孔（八連管）0.25μL配制。

2.引物配制：按照每孔上下游引物的混合物為1μL配制混合液。

3.將上述混合物離心并混勻，依次加入到八連管中，（1）中混合液每孔貼上壁加7μL,（2）中混合液每孔加1μL，并注意將目的引物與內(nèi)參引物區(qū)分，避免上樣時出錯。

4.將八連管離心—震蕩—再離心，使得引物與底物充分混勻，將離心好的八連管放至PCR儀，啟動Bio-Rad CFX Manager程序。

RT-PCR結(jié)束后，保存曲線備用，并分析相應(yīng)結(jié)果，繪制相應(yīng)mRNA表達水平圖比較轉(zhuǎn)染效率，也可使用轉(zhuǎn)染效率（%）=（1-2^-△△CT)*100%直接計算。

注意事項：

1.實驗過程中必須戴口罩、手套，盡量避免其他人員干擾。

2.RT試劑盒從冰箱拿出，應(yīng)該充分解凍，瞬離后混勻，放于冰上，可在冰上加樣，避免反復(fù)凍融。試劑可以用數(shù)字貼紙編號，避免漏加、錯加試劑。

3.取用不同的試劑時，必須更換槍頭，樣本之間要避免交叉污染。

4.反應(yīng)體系配好之后，應(yīng)充分混勻，瞬離，并且彈去管內(nèi)的氣泡。

5.每個樣品至少3個平行孔，所有成份加完后，離心去除氣泡。

6.如果目的基因表達量非常低，最多加入1μg TotalRNA，否則加入RNA量過高,可能會超出后續(xù)PCR的線性范圍。

二、蛋白水平——WB驗證

1.收集轉(zhuǎn)染后的細胞提取蛋白并根據(jù)目的分子量大小選擇配制適宜濃度的膠。

2.將變性后的蛋白液先震蕩，再離心，可根據(jù)BCA測定的蛋白濃度上樣；

3.根據(jù)日常經(jīng)驗進行電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、敷抗體即可。

4.曝光條帶保存?zhèn)溆?，使用Image J計算灰度值，繪制蛋白水平圖，分析轉(zhuǎn)染效率。

注意事項：

1.背景臟，不規(guī)則成片背景，可能是封閉不充分，可以延長封閉時間或者更換封閉液。

2.條帶上有黑色斑點，最常見的原因是封閉液沒有完全溶解。

3.注意手不要觸碰NC膜或是PVDF膜。

4.轉(zhuǎn)膜液使用次數(shù)不宜過多，否則影響轉(zhuǎn)膜效率。

三、驗證注意事項

1.對于轉(zhuǎn)染后的細胞，由于轉(zhuǎn)染試劑毒性或敲減某基因可造成細胞狀態(tài)不好或細胞數(shù)量較低，不管提蛋白或RNA，都應(yīng)小心操作，避免細胞太少。

2.轉(zhuǎn)染48h后可根據(jù)轉(zhuǎn)染方式進行換液等操作，一般而言，對于敲減的細胞細胞一般會出現(xiàn)細胞變圓、細胞漂起來等現(xiàn)象，因此在選擇收細胞天數(shù)時應(yīng)多加注意，防止細胞死光，我個人而言，使用Lipofectamine RNAiMAX Reag轉(zhuǎn)染最多可維持5-6天。

3.由于最終生物功能還是由蛋白決定，因此最終確定轉(zhuǎn)染效率一般均需進行Western blot。