一、siRNA設計

小干擾RNA（Small interfering RNA；siRNA）是一段長度在20-25個核苷酸之間的RNA雙鏈，其生物應用較多，目前主要用于干擾RNA，達到調節基因表達（敲減）的目的，其本質是siRNA和相應的mRNA特異性結合、降解，繼而實現阻滯mRNA繼續翻譯的目的。

設計原則：

1.siRNA序列不宜過長，超過30nt易導致其與其他mRNA非特異性結合，一般以19-25nt之間為宜。

2.GC含量控制在35-55%之間，基因沉默效果最好。

3.siRNA序列設計的靶序列一般為目的基因的CDS序列。

4.一般siRNA需設計2-4條，另需要對照1-2條，序列設計完成后需要在BLAST中（BLAST: Basic Local Alignment Search Tool (nih.gov)進行比對，選擇與靶基因特異性結合的序列進行合成即可。

上述原則是在設計siRNA時可以選擇的一些參數，此外還有較為細節的原則如siRNA序列選擇的位置、開始的堿基及序列及避免堿基單一等原則在使用三方網站設計時一般會自動規避。

siRNA合成后，一般是粉末狀，根據說明書加入相應稀釋液配置成相應濃度，配置完成后建議使用最小體積的Ep管分裝（推薦5μl分裝一次）并于-80℃冰箱保存備用，避免反復凍融。

二、siRNA轉染

（1）Lipo8000™轉染

Lipo8000™試劑是一種簡便高效的轉染試劑，適用于質粒、siRNA及其他DNA復合物的轉染，同時，Lipo8000™試劑具有較小的細胞毒性，轉染后全程一般無需換液，24-48h后可直接收集細胞進行WB或RT-PCR驗證。

轉染步驟：

1.轉染前一天鋪細胞，保證第二天轉染前細胞密度可達70-80%。

2.轉染前準備Opti-MEM培養基、Lipo8000™試劑、siRNA及其他常見處理細胞的試劑、耗材。

3.轉染復合物配置如下表，按體積依次加入相應試劑并輕輕混勻，室溫孵育20mins。

4.復合物等待期間將培養基換成新鮮的完全培養基（六孔板-2mL）。

5.20分鐘后，將復合物加入到相應孔中，輕輕混勻后放入培養箱，禁止振蕩混勻。

注意事項：

1.由于Lipo8000™試劑毒性較小，轉染前換液可加含抗生素的完全培養基。

2.轉染siRNA后，驗證時間至少要求轉染后48h，一般3-5天后驗證時才會有較為明顯的蛋白表達或RNA水平下降。

（2）Lipofectamine ™ RNAiMAX轉染

Lipofectamine ™ RNAiMAX轉染主要供siRNA和Stealth ™ RNAi 雙鏈體轉染使用，具有轉染效率高、對細胞毒性小等優點。

轉染步驟：

1.轉染前準備試劑包括：Opti-MEM培養基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA、不加雙抗的10%FBS培養基、胰酶、PBS緩沖液等常見處理細胞的試劑。

2.細胞密度≥90%。

3.按正常處理細胞的流程將長滿的細胞經過胰酶消化離心后去上清，注意此處需要加無雙抗的10%FBS培養基1ml進行細胞重懸，重懸完后根據細胞生長速度鋪細胞，保證轉染完后24h細胞密度達到30-50%。

4.轉染復合物制備：根據說明書制備轉染復合物，添加量如下表所示。根據轉染的實際用量將Opti-MEM培養基、Lipofectamine™ RNAiMAX試劑、siRNA依次加入到一個無菌Ep管中，按照先加Opti-MEM培養基、再加siRNA最后加Lipofectamine™ RNAiMAX試劑的順序，輕輕混勻室溫孵育20mins。

5.20mins后依次將轉染復合物加入細胞培養皿種，輕輕混勻，放入細胞培養箱內。

注意事項：

1.轉染后24h內最好不要挪動細胞，也不要拿出在顯微鏡下觀察，期間也無需進行細胞換液。其表型可能在48-72h后逐漸顯現，根據實際情況進行細胞換液或收細胞進行后續驗證。

2.此種轉染方式最長可維持5-7天的基因敲除效果。

3. Lipofectamine™ RNAiMAX試劑在冰箱4℃保存，切記不可冷凍。