摘 要： 建立高效液相色譜法測定化妝品中3種甘草類功效成分。樣品經75%（體積分數(shù)）甲醇溶液超聲提取，采用Luna C18 （2）100A色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以0.05%（體積分數(shù)）磷酸溶液-乙腈為流動相，梯度洗脫，流量為1.0 mL/min，進樣體積為10 μL，柱溫為30 ℃，采用二極管陣列檢測器，在275、251、372 nm波長下分別測定甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A，以保留時間和紫外吸收光譜定性，外標法定量。甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A的質量濃度分別在1～20、2～40、0.5～10 μg/mL范圍內與對應的色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)均為0.999 9。平均回收率為95.8%～111.8%，測定結果的相對標準偏差均不大于3.6%（n=6）。檢出限為0.05～0.6 μg/g。該方法操作簡便，靈敏度高，適用于化妝品中甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A的檢測。

關鍵詞： 高效液相色譜法； 甘草素； 甘草酸； 甘草查爾酮A； 化妝品

 

隨著人們生活水平的提高，愈加追求天然、綠色、安全、健康的生活品質，天然中草藥作為化妝品功效成分的添加已經成為市場發(fā)展的主流，深受消費者的喜愛[1]。甘草是豆科植物烏拉爾甘草、脹果甘草和光果甘草的干燥根和根莖[2]。甘草中含有大量的美白活性成分，如黃酮類、三萜類及多糖類，因能抑制酪氨酸酶活性，具有美白和抗炎作用，并具有一定的抗氧化作用，在化妝品中廣泛添加。甘草中美白效果較好的有甘草素[3]，其可作為指示甘草提取物保濕活性的質量標志物[4]。已發(fā)布的已使用化妝品原料目錄(2021年版)共收錄27個與甘草相關的物質，據(jù)文獻統(tǒng)計報道，2014～2021年甘草在化妝品中使用頻次超過10萬次[5]，其中使用頻率較高的是光果甘草根提取物[6]。隨著越來越多消費者重視化妝品功效，一些企業(yè)往往會將功效成分作為營銷噱頭，實際添加成分、添加量有待考究，因此有必要建立甘草類功效成分檢測方法，評估產品的實際添加情況，為化妝品質量監(jiān)管提供基礎數(shù)據(jù)。

目前，甘草類功效成分檢測方法主要有高效液相色譜法[7?9]、超高效液相色譜法[10]、液相色譜-質譜法等[11?14]，筆者采用目前化妝品檢測實驗室普遍具備的分析技術，建立高效液相色譜法測定化妝品中3種甘草類功效成分，該方法簡單易操作、靈敏度高、準確度高、重現(xiàn)性好。

 

1、實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：SHIMADZA LC-20AT型，配二極管陣列檢測器，日本島津儀器有限公司。

電子天平：(1)ME204型，感量為0.1 mg；(2)XS205型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

超聲波清洗器：S300H型，德國艾爾瑪公司。

渦旋混合器：LabDancer型，德國艾卡集團。

超純水發(fā)生器：Milli Q Reference型，美國密理博公司。

疏水性PTFE濾膜：0.45 μm，上海安譜實驗科技股份有限公司。

甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A：質量分數(shù)均為98%，上海源葉生物科技有限公司。

甲醇、乙腈：均為色譜純，美國霍尼韋爾公司。

磷酸：優(yōu)級純，上海麥克林生化科技有限公司。

實驗用水為一級純化水。

1.2 標準溶液的配制

標準儲備溶液：稱取甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A各10 mg (精確至0.01 mg)，分別至10 mL容量瓶中，加75%甲醇溶液溶解，定容至標線，搖勻待用。

混合標準溶液：依次取上述標準儲備溶液2、4、1 mL至同一20 mL容量瓶中，加75%甲醇溶液溶解，定容至標線，搖勻待用。

系列混合標準工作溶液：取上述混合標準溶液0.1、0.2、0.4、1、2 mL，分別至10 mL容量瓶中，加75%甲醇溶液溶解，定容至標線，即得甘草素質量濃度分別為1、2、4、10、20 μg/mL，甘草酸質量濃度分別為2、4、8、20、40 μg/mL，甘草查爾酮A質量濃度分別為0.5、1、2、5、10 μg/mL的系列混合標準工作溶液。

1.3 樣品處理

稱取樣品1 g (精確至0.1 mg)至10 mL具塞比色管中，加入5 mL 75%甲醇溶液，渦旋震蕩至均勻，再定容至標線，超聲提取15 min，必要時離心，經0.45 μm疏水性PTFE濾膜過濾，取濾液作為待測液。

1.4 液相色譜條件

色譜柱：Luna C18 (2) 100A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國飛諾美公司)；進樣體積：10 μL；柱溫：30 ℃；檢測波長：甘草素為275 nm、甘草酸為251 nm、甘草查爾酮A為372 nm；流動相：A相為0.05%磷酸溶液，B相為乙腈，流量：1.0 mL/min；洗脫方式：梯度洗脫，梯度洗脫程序見表1。

表1   梯度洗脫程序

Tab. 1   Gradient elution program

 

2、 結果與討論

 

2.1 色譜柱的選擇

參考相關文獻[7?10]，選擇使用廣泛的C18色譜柱，按1.4條件，分別考察了Luna C18 (2) 100A柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)、CAPCELL PAK MGⅡ C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)三款色譜柱，結果表明三款色譜柱均分離良好、色譜峰形尖銳，能滿足系統(tǒng)適用性要求，最終選擇Luna C18 (2) 100A色譜柱進行檢測。

2.2 流動相的選擇

分別考察了體積比均為25∶75的乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.05%磷酸溶液、乙腈-0.01%磷酸溶液5種流動相體系。結果表明，在乙腈-水、甲醇-水體系下，甘草酸均無保留，且甲醇-水體系洗脫能力較弱，目標物集中在高有機相出峰。參考相關文獻[7?10]，水中加入適量磷酸，在0.1%磷酸溶液(pH值2.13)、0.05%磷酸溶液(pH值2.34)下甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A分離良好、峰形尖銳，滿足實驗要求。在0.01%磷酸溶液(pH值2.88)下甘草酸色譜峰形較差，不適用于分析。基于對色譜柱的保護，選擇pH值稍高的0.05%磷酸溶液與乙腈組成流動相體系。不同波長下3種甘草類功效成分混合標準溶液色譜圖見圖1。

圖1   混合標準溶液色譜圖

Fig. 1   Mixed standard solution chromatograms

2.3 檢測波長的選擇

使用二極管陣列檢測器，在190～700 nm范圍內進行光譜掃描，甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A分別在275、251、372 nm波長處有最大吸收，基于所檢測物質為中藥提取物，且3種成分最大吸收波長各異，為了達到更好的檢測靈敏度，所以選擇各自最大吸收波長為檢測波長。各成分紫外吸收光譜分別見圖2。

圖2   各成分紫外吸收光譜圖

Fig. 2   UV absorption spectra of each component

2.4 提取溶劑與超聲時間的選擇

3種甘草類功效成分均易溶于極性溶劑，選擇水劑、乳液、膏霜3種劑型樣品，分別考察了常用于化妝品且毒性較低的75%乙醇溶液、75%甲醇溶液作為提取溶劑，結果表明，兩種溶劑都能均勻分散3種劑型樣品。由于75%乙醇溶液提取完成后，部分膏霜樣品因乳化嚴重導致過濾困難，75%甲醇溶液則可避免這個問題，所以選擇75%甲醇溶液作為提取溶劑。確定了提取溶劑后，在空白樣品中加入混合標準溶液，分別考察15、20、25 min超聲提取時間，結果顯示，15、20、25 min各成分的回收率無明顯區(qū)別，所以超聲提取時間選擇15 min，結果見表2。

表2   不同超聲時間回收率

Tab. 2   Recovery rate of different ultrasound times

 

2.5 濾膜的選擇

甘草類功效成分的檢測中濾膜的影響罕見文獻討論，建立方法的過程中使用常規(guī)尼龍有機濾膜和疏水性PTFE濾膜過濾回收率樣品，回收率結果見表3。由表3可見，甘草酸、甘草查爾酮A可能被濾膜吸附，導致回收率偏低，膏霜樣品中3種成分的回收率均受影響且吸附情況更嚴重；PTFE濾膜具有更強的化學兼容性，選用疏水性PTFE濾膜過濾，則得到滿意的回收率結果。

表3   2種濾膜回收率

Tab. 3   Filter membrane recovery rates of two types

2.6 線性范圍和檢出限

按1.4條件，采用外標定量分析法，測定了系列混合標準工作溶液。分別以質量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線，并進行線性回歸分析。結果表明，甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A在質量濃度范圍內與對應的色譜峰面積均具有良好的線性關系，相關系數(shù)均為0.999 9。根據(jù)《化妝品安全技術規(guī)范》(2015年版)衛(wèi)生化學檢測方法總則要求，檢出限以3倍空白噪聲時對應的質量濃度表示[15]。實驗結果見表4。

表4   線性范圍、線性方程、相關系數(shù)、方法檢出限

Tab. 4   Linear range， linear equation, correlation coefficient, method detection limit

2.7 樣品加標回收與精密度試驗

稱取水劑、乳液、膏霜3種劑型空白樣品各1 g，進行高、低兩個濃度水平加標，每個加標水平平行制備6份，按照該方法進行樣品處理和測定，計算回收率和相對標準偏差。結果表明，樣品的平均回收率為95.8%～111.8%，測定結果的相對標準偏差為小于3.6%。實驗結果見表5。空白樣品與加標樣品色譜圖分別見圖3和圖4。

表5   加標試驗和精密度試驗結果

Tab. 5   Results of spiked recovery and precision test

圖3   空白樣品色譜圖

Fig. 3   Chromatogram of blank sample

圖4   甘草素加標樣品色譜圖

Fig. 4   Chromatogram of glycyrrhizin spiked sample

2.8 穩(wěn)定性試驗

考察了高、低兩個濃度水平的空白基質樣品加標溶液的穩(wěn)定性，于4 ℃冰箱中放置3 d，比較甘草素、甘草酸、甘草查爾酮A色譜峰面積并計算相對偏差，結果見表6。由表6可見，3種成分在3 d內穩(wěn)定，穩(wěn)定性相對偏差小于1.1%。

表6   穩(wěn)定性測定結果

Tab. 6   Stability determination results

 

3、 結語

 

建立的化妝品中3種甘草類功效成分的檢測方法，操作簡便，靈敏度高、準確度好。該方法為新型中藥功效化妝品的研究提供參考，為化妝品監(jiān)管部門提供市場基礎數(shù)據(jù)和技術保障。

 

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引用本文： 劉小娟，徐嘉銘，李楊杰 . 高效液相色譜法測定化妝品中3種甘草類功效成分［J］. 化學分析計量，2024，33（10）：74. (LIU Xiaojuan, XU Jiaming, LI Yangjie. Determination of 3 licorice active ingredients in cosmetics by high-performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 74.)