摘 要： 建立高效液相色譜法同時測定呋塞米片中6種已知雜質，考察了分析方法的專屬性、線性范圍、靈敏度、準確度、精密度、穩定性及不同定量方式計算相同樣品的差異。結果表明，呋塞米和6種已知雜質的質量濃度在1.0～12.0 μg/mL范圍內與對應的色譜峰面積線性關系良好，相關系數大于0.999，且6種已知雜質的3種濃度水平加標回收率為95.2%～101.9%，測定結果的相對標準偏差均低于6.5%。該方法簡便、快速，專屬性強，準確度與精密度較好，可用于呋塞米片的質量控制。

關鍵詞： 高效液相色譜法； 呋塞米片； 有關物質； 質量控制

 

呋塞米化學名為2-[(2-呋喃甲基)氨基]-5-(氨磺酰基)-4-氯苯甲酸，屬于強效髓袢利尿藥，常用于治療充血性心力衰竭、高血壓、水腫等疾病[1?2]，因其利尿速度快、時間短，且不良反應小，使得呋塞米片常作為一線降壓藥使用[3?4]。由于藥物在貨架期內受溫度、濕度、光照等外界條件影響，主成分易遭受破壞，產生降解雜質[5?6]。為保證患者的用藥安全，現行版中國藥典對其原料和注射劑的有關物質限度均進行規定，但未對呋塞米片的有關物質提出要求，而現行版美國藥典對呋塞米片的有關物質僅控制了雜質B (4-氯-5-氨磺酰鄰氨苯甲酸)的限度。根據文獻報道，呋塞米的主要降解雜質共有6種，分別為雜質A、B、C、D、E、F[7]，且均不易購得，若在日常質量控制中，采取外標法定量分析呋塞米片中6種雜質的質量分數較難實現。高效液相色譜法測定呋塞米含量的研究較多[8?10]，但未有文獻對呋塞米片的有關物質控制研究進行報道，為此有必要建立一種簡便、高效的分析方法同時測定呋塞米片中6種有關物質的質量分數。高效液相色譜法因具有操作簡便、專屬性強、準確度高、成本較低等優點，而被廣泛應用于藥物的含量和有關物質檢測[11?13]。以樣品溶液中呋塞米質量濃度的1.0% (10.0 μg/mL)作為雜質控制限度，通過強制破壞實驗，考察液相色譜條件對降解雜質的檢出能力，及是否干擾6種已知雜質的色譜峰，并比較主成分自身對照法與外標法定量分析呋塞米片中有關物質質量分數的差異。該研究既可為準確測定呋塞米片中有關物質的質量分數提供參考，也能為相關產品的質量標準提升提供借鑒。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：U3000型，美國賽默飛世爾科技有限公司。

電子天平：(1)MS204/A型，感量為0.1 mg；(2)XPR226CDR/AC型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

pH計：400-B型，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

鼓風干燥箱：DHG-9078A型，上海捷呈實驗儀器有限公司。

超聲波清洗機：KS-20DQT型，望皖科技(上海)有限公司。

呋塞米片：20 mg/片，市售。

呋塞米對照品：質量分數為99.3%，中國食品藥品檢定研究院。

呋塞米雜質A對照品、呋塞米雜質B對照品、呋塞米雜質C對照品、呋塞米雜質D對照品、呋塞米雜質E對照品、呋塞米雜質F對照品：質量分數分別為97.2%、98.4%、98.1%、97.5%、98.6%、99.1%，加拿大TRC公司，具體名稱見表1。

表1   呋塞米片6種有關物質

Tab. 1   Six kinds of related substances in furosemide table

 

鹽酸、氫氧化鈉、雙氧水、十六烷基三甲基溴化銨、磷酸二氫鉀、氨水：分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

異丙醇：色譜純，德國默克公司。

1.2 色譜條件

色譜柱：Ultimate C18柱[250 mm×4.6 mm，5 μm，月旭科技(上海)股份有限公司]；流動相：0.3%磷酸二氫鉀溶液-0.4%十六烷基三甲基溴化銨(加入氨水調節pH值至7.0)-異丙醇(70∶30，體積比)，流量為1.0 mL/min；檢測波長：238 nm；進樣體積：20 μL；柱溫：40 ℃。

1.3 溶液配制

稀釋劑：0.3%磷酸二氫鉀-0.4%十六烷基三甲基溴化銨(加入氨水調節pH值至7.0)-異丙醇(70∶30，體積比)。

樣品溶液：取呋塞米片20片，研細后，精密稱取適量(約相當于呋塞米50.0 mg)，置于50 mL容量瓶中，加入20 mL稀釋劑，超聲溶解(100 W、5 min)后，用稀釋劑定容、搖勻。測定時過濾，取續濾液，即得樣品溶液。

混合對照品溶液：精密稱取呋塞米雜質A、B、C、D、E、F及呋塞米對照品適量，用稀釋劑稀釋，配制得到每1 mL分別含有0.01 mg的雜質A、B、C、D、E、F及呋塞米混合對照品溶液。

空白輔料溶液：根據說明書所列輔料，配制空白輔料溶液。

對照樣品溶液：精密移取樣品溶液1 mL，置于100 mL容量瓶中，加入稀釋劑定容后搖勻。

1.4 實驗方法

取樣品溶液、混合對照品溶液和對照樣品溶液，按1.2色譜條件進樣分析，記錄色譜圖至主成分保留時間的2倍，記錄色譜峰峰面積，按外標法與主成分自身對照法定量分析6種有關物質的質量分數，采用不加校正因子的主成分自身對照法測定其他雜質的質量分數。

 

2、 結果與討論

 

2.1 色譜條件選擇

2.1.1 檢測波長選擇

取混合對照品溶液在200～400 nm波長的紫外吸收光譜下掃描，發現在238、271、333 nm波長處均有吸收，且越靠近短波長吸收強度較大，考慮待測物的檢測靈敏度，并結合現行版歐洲藥典對呋塞米原料藥有關物質的檢測波長為238 nm，選擇檢測波長為238 nm。

2.1.2 柱溫選擇

采用Ultimate C18 (250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱，按照1.2色譜條件，分別考察不同柱溫(25、30、35、40、45 ℃)對混合對照品溶液中各色譜峰的出峰影響。結果表明，當柱溫在25、30、35和45 ℃時，雜質A與雜質C的分離度不符合要求，不能完全分離。當柱溫為40 ℃時，呋塞米及其他6種雜質的色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，因此選擇柱溫為40 ℃。

2.1.3 流動相選擇

以0.3%磷酸二氫鉀溶液-0.4%十六烷基三甲基溴化銨(加入氨水調節pH至7.0)為流動相A，異丙醇為流動相B，分別考察不同體積比(60∶40、70∶30、80∶20)對各色譜峰的出峰影響。結果發現，隨著流動相中異丙醇的增加，呋塞米與其他6種有關物質的保留時間逐漸縮短，同時各色譜峰的分離度不斷減小，當流動相A與流動B的體積比為70∶30時，各色譜峰的保留時間合適，且與相鄰峰的分離度大于1.5，因此選擇流動相為0.3%磷酸二氫鉀-0.4%十六烷基三甲基溴化銨(加入氨水調節pH至7.0)-異丙醇(70∶30)。

2.2 專屬性考察

按照1.2色譜條件，分別取空白輔料溶液、混合對照品溶液及樣品溶液進樣，系統適用性溶液色譜圖見圖1。空白輔料溶液、樣品溶液中未有色譜峰干擾主成分與6種有關物質出峰，專屬性好。另外主成分與其他6種有關物質的分離度均大于1.5，各色譜峰的理論塔板數均大于5 000，證明該色譜條件可使主成分與其他6種有關物質有效分離。

圖1   系統適用性溶液色譜圖

Fig. 1   Chromatogram of system suitability solution

1—雜質E；2—雜質B；3—雜質C；4—雜質A；5—呋塞米；6—雜質F；7—雜質D

 

2.3 主成分強制降解

根據文獻中破壞試驗方法[14?15]，分別采取高溫、光照、酸、堿、氧化和高濕條件對樣品溶液進行破壞。具體操作如下：(1)取呋塞米片置于60 ℃下30 d，隨后制備樣品溶液，即得高溫破壞試樣；(2)取呋塞米片置于強光(4 500±500) lx下照射30 d，隨后制備樣品溶液，即得光照破壞試樣；(3)向超聲溶解的樣品溶液加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL搖勻，置于60 ℃水浴2 h，再加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL中和，隨后用稀釋劑定容搖勻，即得強酸破壞試樣；(4)向超聲溶解的樣品溶液加入1 mol/L氫氧化鈉溶液1 mL后搖勻，置于60 ℃水浴2 h，再加入1 mol/L鹽酸溶液1 mL中和，隨后用稀釋劑定容搖勻，即得強堿破壞試樣；(5)向超聲溶解的樣品溶液加入30%過氧化氫1 mL后搖勻，于室溫下放置6 h，用稀釋劑定容搖勻，即得氧化破壞試樣；(6)取呋塞米片置于25 ℃、相對濕度為90%環境下30 d后制備樣品溶液，即得高濕破壞試樣。將上述6種強制降解的試樣，按照1.2色譜條件進樣，測定各雜質的質量分數，結果見表2。由表2可知，強堿、氧化與高濕破壞的試樣中雜質峰個數增長較少，表明呋塞米在上述破壞條件下較穩定，而在光照、強酸和高溫破壞的試樣中雜質增長量較多，但降解雜質的色譜峰均能與主成分有效分離，同時主峰純度大于990，表明降解雜質與主成分色譜峰保留時間相同的可能性較低，另外物料平衡率(破壞后各色譜峰的峰面積之和/破壞前各色譜峰的峰面積之和)為96.3%～99.5%，表明該方法對主成分降解雜質的檢出能力較強，方法專屬性較好。

表2   呋塞米片的強制降解結果

Tab. 2   Forced degradation results of Furosemide Tables

2.4 線性范圍考察

精密稱取呋塞米及6種有關物質對照品各約10 mg，置于50 mL容量瓶中，用稀釋劑定容、搖勻，作為混合對照品儲備液。隨后分別精密移取0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mL混合對照品儲備液置于100 mL容量瓶中，用稀釋劑定容后搖勻，便分別得到1.0、2.0、4.0、6.0、10.0、12.0 μg/mL呋塞米與6種雜質的混合對照品溶液，按照1.2色譜條件進樣，記錄色譜圖。以質量濃度為橫坐標，相應色譜峰面積為縱坐標，繪制線性回歸方程。以呋塞米與6種雜質的線性回歸方程斜率的比值，計算校正因子f，結果見表3。由表3可見，所有方程的相關系數均大于0.999，表明在1.0～12.0 μg/mL范圍內，主成分和6種已知雜質質量濃度與相應色譜峰面積的線性關系良好。

表3   呋塞米與6種有關物質的線性方程、相關系數

Tab. 3   Linear equations and correlation coefficients of furosemide and 6 related substances

 

2.5 檢出限與定量限

精密移取1.3中1.0 μg/mL混合對照品溶液少許，用稀釋劑逐步稀釋，按照1.2色譜條件進樣，分別以基線噪音的3倍(S/N=3)和10倍(S/N=10)作為相應目標化合物的檢出限與定量限 [16?17]，結果見表4。由表4可見，6種有關物質的定量限質量濃度均不高于雜質的控制限度（10 μg/mL），從而滿足呋塞米片中有關物質的定量分析要求。

表4   不同物質的檢出限與定量限(n=6)

Tab. 4   LODs and LOQs in different substances (n=6)

 

2.6 準確度試驗

準確稱取研磨后的呋塞米片(呋塞米約為10 mg)，置于10 mL容量瓶中，加入5 mL稀釋劑超聲溶解(100 W、5 min)后，再分別加入低、中、高質量濃度的6種有關物質對照品溶液，用稀釋劑定容避光搖勻，另配制不加雜質對照品的樣品溶液，隨后按照1.2色譜條件進樣，測定各加標樣品溶液中雜質的質量分數，并計算回收率，結果見表5。由表5可見，6種有關物質的加標回收率為95.2%～101.9%，表明該方法對呋塞米片中6種有關物質檢測結果準確度較好。

表5   6種有關物質的回收率

Tab. 5   Recoveries of 6 related substances

注：“-”表示未檢出，下同。

 

2.7 精密度試驗

以廠家A生產的呋塞米片作為測定對象，由不同實驗人員按1.4方法對其進行測定，樣品平行測定6次，結果見表6。由表6可見，最大單個雜質檢測結果的相對標準偏差(RSD)為5.2%～6.2%，雜質總量的RSD為2.4%～2.6%，說明該方法的精密度較好，滿足不同實驗室的分析要求。

表6   精密度試驗結果

Tab. 6   Results of precision test ( % )

 

2.8 穩定性試驗

按照1.2色譜條件考察10.0 μg/mL混合對照品溶液和樣品溶液與對照樣品溶液在0、4、8、12、18、24、30 h的色譜圖，統計各溶液目標物的穩定性情況，具體見表7、表8。不同時間下混合對照品溶液中雜質A、B、C、D、E、F質量分數較0 h的最大絕對差值分別為0.01%、0.02%、0.01%、0.03%、0.02%和0.02%，可知各雜質色譜峰面積在30 h內無明顯變化。不同時間下樣品溶液中雜質總量較0 h的最大絕對差值為0.02%，而對照樣品溶液中呋塞米的質量分數最大絕對差值為0.03%，表明樣品溶液與對照溶液的最長存放時限均可維持30 h。

表7   混合對照品溶液的穩定性結果

Tab. 7   Stability results of mixed control solution ( % )

表8   樣品溶液與對照樣品溶液的穩定性結果

Tab. 8   The stability results of the sample solution and the control sample solution ( % )

 

2.9 樣品有關物質檢測結果

采取1.3色譜條件檢測不同廠家生產的呋塞米片中有關物質，記錄色譜圖至主成分色譜峰保留時間2倍。根據表3中校正因子，采用主成分自身對照法計算6種有關物質的質量分數，并與外標法定量分析結果進行比較，另通過不加校正因子的主成分自身對照法計算未知單個雜質的質量分數，并計算雜質總量，結果見表9。從表9可見，不同廠家生產的呋塞米片中均能檢出雜質B，但質量分數均低于0.3%。采用主成分自身對照法與外標法測定3家呋塞米片的6種有關物質的質量分數，最大絕對差值低于0.02%，可知兩種定量方法無明顯差異。為節省對照品，優選主成分自身對照法定量分析呋塞米片中有關物質質量分數。

表9   不同廠家呋塞米片的有關物質質量分數

Tab. 9   Contents of related substance of Furosemide Tables from different companies ( % )

 

3、 結語

 

建立了高效液相色譜法同時測定呋塞米片中6種有關物質質量分數，考察了6種已知雜質(雜質A、B、C、D、E、F)對主成分的校正因子，同時檢測不同廠家生產的呋塞米片有關物質。通過強制破壞主成分，各破壞條件下樣品中色譜峰總面積基本滿足質量守恒要求，且空白溶劑與輔料對主成分與6種有關物質的檢出無干擾，表明該方法能夠對可能存在的工藝與降解雜質有效檢出，專屬性較好。另外在不同加標量下，6種有關物質的回收率為95.2%～101.9%，方法準確度較高。采取主成分自身對照法與外標法對同一樣品的定量分析結果無明顯差異，因此為降低檢測成本，優選主成分自身對照法定量分析呋塞米片各有關物質的質量分數，從而滿足相關產品有關物質的質量控制要求。

 

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引用本文： 邵雪力，康冰瑩，費佳，等 . 高效液相色譜法同時測定呋塞米片中6種有關物質［J］. 化學分析計量，2024，33（10）：68. (SHAO Xueli, KANG Bingying, FEI Jia, et al. Simultaneous determination of 6 related substances in Furosemide Tables by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(10): 68.)