1、復蘇后細胞漂浮

1、細胞本身貼壁能力較弱

具體分析：以細胞轉染的明星細胞293T為例，它生長較快，但貼壁能力弱，容易出現明顯的成片脫落現象。

解決辦法：提前使用明膠包被板子，增強吸附性。另外，還建議使用TC處理（tissue culture treated）的培養瓶/皿促進細胞貼壁附著。

2、培養條件不適合

具體分析：以293T細胞培養舉例，推薦使用的培養基為DMEM（高糖）+10%FBS，但是如果使用RPMI-1640+10%FBS做為培養基，培養液糖分不足，故不夠支持細胞生長所需。雖然用錯了培養基，但這不代表細胞一定不能生長。但如果培養細胞中長時間使用不正確的培養基，甚至缺少必要營養組分（例如優質的血清），那細胞真就容易漂了。

解決辦法：參照細胞使用說明書或者實驗室預實驗結果，使用合適的培養體系。對于間充質干細胞這類“口味挑剔”的細胞，培養基和血清的質量要求會更高。

3、復蘇過程中操作不當

具體分析：復蘇過程水溫太低，解凍時間不足，冰晶損傷了細胞；水溫太高，燙傷了細胞。

解決辦法：復蘇細胞過程，一般是從液氮罐中取出凍存管，立即放入到37℃水槽中快速解凍，搖晃凍存管，確保在1分鐘內完成解凍。

4、去除凍存液中殘留的DMSO過程，離心對細胞造成損傷

具體分析：在細胞復蘇過程中，解凍完畢之后，為了防止殘留DMSO對細胞的毒性影響，很多小伙伴會將細胞懸液轉入到15mL離心管內，離心去上清，再重懸細胞接種培養。但這種情況，會導致剛復蘇還極為脆弱的細胞，因為離心機的離心力更為脆弱甚至破損死亡。

解決辦法：其實除了少數對DMSO敏感的細胞之外（例如DMSO誘導HL-60分化成類中性粒細胞），絕大多數細胞應在解凍之后，直接接種在培養皿內，隔天再更換新鮮培養基去除DMSO。

2、傳代后細胞漂浮較多

1、胰酶消化時間過長（主要針對貼壁細胞）

具體分析：不同貼壁細胞的黏附能力不同，因此胰酶消化時間需要考慮到細胞性質。例如貼壁能力弱的293T細胞，消化時間為2-3分鐘（甚至可能更短），而A549細胞系的消化時間則是5-6分鐘。同時，不同實驗室條件也有差別，甚至不同品牌的胰酶消化能力也有差距，需要控制消化條件。

解決辦法：消化過程中，縮短胰酶消化的時間，以顯微鏡下觀察到細胞變圓作為終止消化的標準。

2、過度吹打細胞帶來機械損傷

具體分析：吹打細胞的情況主要有兩種，一是胰酶消化時間不足，為了收集更多的細胞，不少小伙伴會對剩余的貼壁細胞進行吹打。二是在接種細胞之前，去除上清液后加入新的培養基重懸細胞時候的吹打。這兩種情況下，吹打細胞的過程太長或者用力過度，會帶來細胞承受不了的剪切力和擠壓力等機械應力。

解決辦法：

胰酶使用前進行復溫，胰酶消化時間不能太短，以顯微鏡下觀察到細胞變圓作為終止消化的標準。

減少吹打細胞的次數和時間，吹打至肉眼無可見細胞團即可。

3、培養條件不適合

同上述PART 01 “細胞漂浮”問題解答。

4、細胞接種密度過高

具體分析：細胞多，平分到的培養基營養成分就顯得“僧多粥少”。同一批次，不同培養皿內接種的細胞數量差異太大。或者一個培養皿內，細胞分布不均，存在某些區域細胞過多，而另外區域細胞數量極少甚至沒有的情況。

解決辦法：細胞重懸均勻，推薦1:3或者1:4的比例進行傳代。小伙伴們也可以根據細胞量進行更改，進行1:2或者1:5傳代。接種細胞之后，對培養皿進行水平均勻晃動，畫數字“8”或者十字晃動，保證細胞在培養皿上均勻分布。

3、細胞生長太慢

1、細胞接種密度過低

具體分析：與細胞接種密度過高不同的是，接種的細胞數量少，細胞相對獲得的營養成分極為充足并不能幫助細胞快快生長。

解決辦法：根據細胞數量調整傳代比例，適當增加接種細胞的初始濃度。

2、培養基配置/使用/保存不當

具體分析：培養基在室溫放置時間過久，導致效能下降。也有可能是血清批次問題，血清效能的不穩定導致不同時間配置的培養基效能存在差異。

解決辦法：完全培養基配置時注意各組分保存溫度及性狀是否正常，無異常再進行配置；另外，使用效能穩定的血清，以保證不同批次甚至不同類型細胞的穩定生長。