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嘉峪檢測(cè)網(wǎng) 2024-10-14 09:07
為了能有效地破碎細(xì)胞,并盡可能減少產(chǎn)物的破壞,已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎的方法,通常可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩類。
一,機(jī)械法
常用的機(jī)械破碎方法是基于液相或固相剪切力,這些剪切力可以在高壓勻漿器或機(jī)械驅(qū)動(dòng)的破碎機(jī)如膠質(zhì)磨、珠磨等設(shè)備中獲得。在高壓勻漿器中,進(jìn)入高壓室中的細(xì)胞懸浮液被強(qiáng)迫通過一個(gè)狹窄的小孔,由于產(chǎn)生液相剪切力引起細(xì)胞破碎。在機(jī)械驅(qū)動(dòng)的破碎機(jī)中,剪切力是由細(xì)胞與設(shè)備中的固體表面間的相互作用產(chǎn)生的,這種剪切力場(chǎng)之間的相互作用較復(fù)雜,目前了解得還不夠深入,工程設(shè)計(jì)大多數(shù)靠經(jīng)驗(yàn)。
1, 高壓勻漿器:高壓漿器是用作細(xì)胞破碎的較好的設(shè)備,它是由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵和排出閥組成,排出閥具有狹窄的小孔,其大小可以調(diào)節(jié)。細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi),在高壓下迫使其在排出閥的小孔中沖擊,并高速撞擊在撞擊環(huán)上,使細(xì)胞得到破碎。在操作方式上,可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式。某些較難破碎的細(xì)胞,如小球菌、鏈球菌、群母菌和乳酸桿菌等,以及處于生長靜止期的細(xì)胞或通入的細(xì)胞濃度較高時(shí),應(yīng)采用多次循環(huán)的方式才能達(dá)到較高的破碎率
2, 高速珠磨機(jī):珠磨是另一種常用的機(jī)械破碎細(xì)胞的方法。利用玻璃小珠與細(xì)胞懸浮液一起快速攪拌,由于研磨作用,使細(xì)胞獲得破碎。
3, 超聲波振蕩器:超聲波具有頻率高、波長短、定向傳播等特點(diǎn),通常在15~25kHz的頻率下操作。超聲波振蕩器有不同的類型,常用的為電聲型,它是由發(fā)聲器和換能器組成,發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流,換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器又可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式,一般破碎效果后者比前者好。超聲波對(duì)細(xì)胞的破碎作用與液體中空穴的形成有關(guān)。當(dāng)超聲波在液體中傳播時(shí),液體中的某一小區(qū)域交替重復(fù)地產(chǎn)生巨大的壓力和拉力。由于拉力的作用,使液體拉伸而破裂,從而出現(xiàn)細(xì)小的空穴。這種空穴泡在超聲波的繼續(xù)作用下,又迅速閉合,產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力,由它引起的粘滯性漩渦在懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力,促使其內(nèi)部液體發(fā)生流動(dòng),而使細(xì)胞破碎。超聲波處理細(xì)胞懸浮液時(shí),破碎作用受許多因素的影響,如超聲波的聲強(qiáng)、頻率、液體的溫度、壓強(qiáng)和處理時(shí)間等,此外介質(zhì)的離子強(qiáng)度、PH值和菌種的性質(zhì)等也有很大的影響。不同的菌種,用超聲波處理的效果也不同,桿菌比球菌易破碎,革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革蘭氏陽性菌易破碎,酵母菌效果較差。
二,非機(jī)械法
適合于破碎微生物細(xì)胞的非機(jī)械法有多種,包括化學(xué)法、酶解法、物理法和干燥法等。
1, 化學(xué)法:采用化學(xué)試劑處理微生物細(xì)胞可以溶解細(xì)胞或抽提某些細(xì)胞組分。用堿處理細(xì)胞,可以溶解除去細(xì)胞壁以外的大部分組分。酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸,通常采用6mol/L HCl處理。此外,某些表而活性劑(如洗滌劑)也常能引起細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來,如對(duì)胞內(nèi)的異淀粉酶可加入0.1%十二烷基硫酸鈉或0.4%triton X-100于菌液中,30℃振蕩30小時(shí)就能較完全地將異淀粉酶抽提出來,且酶的比活較機(jī)械破碎法的高。除上述酸、堿及表面活性劑外,也可采用某些脂溶性有機(jī)溶劑,如丁醇、丙酮、氯仿等它們能溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)化合物,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,將胞內(nèi)產(chǎn)物抽提出來。但是,這些溶劑容易引起生化物質(zhì)破壞,使用時(shí)應(yīng)考慮其穩(wěn)定性,操作要在低溫下進(jìn)行,處理后,還必須將抽提液中的有機(jī)溶劑從生化物質(zhì)中分離回收。
2, 酶解法:酶解法是利用酶反應(yīng)分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵,以達(dá)到破壁的目的。酶解的方法可以在細(xì)胞懸浮液中加入特定的酶,也可采用自溶作用。應(yīng)用酶解需要選擇適宜的酶和酶系統(tǒng),并要控制特定的反應(yīng)條件,某些微生物體可能僅在生長的某一階段或生長處于特定的情況下,對(duì)酶解才是靈敏的。有時(shí),還需附加其他的處理,如輻射,滲透壓沖擊、反復(fù)凍融等或加金屬整合劑 EDTA,除去與膜蛋白結(jié)合的金屬離了,暴露出對(duì)酶解敏感的結(jié)構(gòu)部分,也可利用生物因素以促進(jìn)活性,變得對(duì)酶解作用敏感。
對(duì)于微生物細(xì)胞,常用的酶是菌酶,它能專一的分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的 β(1,4)糖苷鍵,使多糖分解,經(jīng)菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中,細(xì)胞就會(huì)破裂。例如在巨大芽抱桿菌或小球菌懸浮液中加入溶菌酶,很快就產(chǎn)生溶菌現(xiàn)象。除溶菌酶外,還可選用蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明質(zhì)酸酶等。
自溶作用是利用微生物自身產(chǎn)生的酶來溶菌,而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中,大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶,以便生長過程繼續(xù)下去。有時(shí)改變其生長的環(huán)境,可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶,以達(dá)到自溶目的。影響自溶過程的因素有溫度、時(shí)間、pH、緩沖液濃度、細(xì)胞代謝途徑等。微生物細(xì)胞的自溶常采用加熱法或干燥法。例如,谷氨酸產(chǎn)生菌,可加入0.028mol/L Na2CO3和0.018mol/L NaHCO3 pH10的緩沖液,制成3%的懸浮液,加熱至70℃保溫?cái)嚢?0分鐘,菌體即自溶。又如酵母細(xì)胞的自溶需在45~50℃溫度下保持12~24小時(shí)。
采用抑制細(xì)胞壁合成的方法能導(dǎo)致類似于酶解的結(jié)果。某些抗生素如青霉素或環(huán)絲氨酸等,能阻止新細(xì)胞壁物質(zhì)的合成。但是抑制劑加入的時(shí)間很重要,應(yīng)在發(fā)酵過程中細(xì)胞生長的后期加入,只有當(dāng)抑制劑加入后,生物合成和再生還在繼續(xù)進(jìn)行,溶胞的條件才是有利的,因?yàn)樵诩?xì)胞分裂階段,細(xì)胞壁就造成缺陷,即達(dá)到溶胞作用。
3, 滲透壓沖擊法:先把細(xì)胞放在高滲溶液中(例如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)由于滲透壓的作用,細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出,細(xì)胞發(fā)生收縮,當(dāng)達(dá)到平衡后,將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中,由于滲透壓發(fā)生突然變化,胞外的水分迅速滲入胞內(nèi),使細(xì)胞快速膨脹而破裂。
4, 凍結(jié)-融化法:將細(xì)胞放在低溫下冷凍(約-15℃),然后在室溫中融化,如此反復(fù)多次,就能使細(xì)胞壁破裂。凍結(jié)-融化法破壁的機(jī)理有兩方面:一方面在冷凍過程中會(huì)促使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂,從而增加細(xì)胞的親水性能。另一方面,冷凍時(shí)胞內(nèi)水結(jié)晶,形成冰晶粒,引起細(xì)胞膨脹而破裂。
5, 干燥法:經(jīng)干燥后的菌體,其細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化,同時(shí)部分菌體會(huì)產(chǎn)生自溶,然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時(shí),胞內(nèi)物質(zhì)就會(huì)被抽提出來。
干燥法的操作可分空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。酵母菌常用空氣干燥,在25~30℃的熱空氣流中吹干,部分酵母產(chǎn)生自溶,再用水,緩沖液或其他溶劑抽提時(shí),效果就較好。真空干燥適用于細(xì)菌,把干燥成塊的菌體磨碎再進(jìn)行抽提。冷凍干燥適用于制備不穩(wěn)定的生化物質(zhì),在冷凍條件下磨成粉,再用緩沖液抽提。
三,各種破碎方法的優(yōu)劣和選擇依據(jù)
由上述可見,細(xì)胞破碎的方法很多,但是它們的破碎效率和適用范圍不同。其中許多方法僅適用于實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模的破碎,迄今為止,能適用于工業(yè)化的大規(guī)模破碎方法還很少,由于高壓勻漿和珠磨兩種機(jī)械破碎方法,處理量大,速度非常快,目前在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛。
在機(jī)械法破碎過程中,由于消耗機(jī)械能而產(chǎn)生大量的熱量,使料液溫度升高,而易造成生化物質(zhì)的破壞,這是機(jī)械法破碎中存在的共同問題,因此,在大多數(shù)情況下都要采取冷卻措施,對(duì)于較小的設(shè)備,可采用冷卻夾套或直接投入冰塊冷卻,但是在大型設(shè)備中熱量的除去是必須考慮的一個(gè)主要問題。特別在超聲波處理時(shí),熱量的驅(qū)散不太容易,很容易引起介質(zhì)溫度的迅速上升,這就限制了它的放大使用,因?yàn)橐斎牒芨叩哪軄硖峁┍匾睦鋮s,在經(jīng)濟(jì)上是不合算的。因此,超聲波振蕩法主要適用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模的細(xì)胞破碎。
非機(jī)械法中的化學(xué)法和酶法應(yīng)用最廣泛。采用化學(xué)法時(shí),特別應(yīng)注意的問題是所選擇的溶劑(酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等)對(duì)生化物質(zhì)不能具有損害作用,在操作后,還必須采用常規(guī)的分離手段,從產(chǎn)物中除去這些試劑,以保證產(chǎn)品的純凈。酶解法的優(yōu)點(diǎn)是專一性強(qiáng),發(fā)生酶解的條件溫和,采用該法時(shí)必須選擇好特定的酶和適宜的操作條件。由于溶菌酶價(jià)格較高,一般僅適用于小規(guī)模應(yīng)用。但是對(duì)于酵母細(xì)胞壁的破碎,已有應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模的報(bào)道。自溶法價(jià)格較低,在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模,但是,對(duì)不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性,自溶后的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾速度也會(huì)降低。抑制細(xì)胞壁合成的方法由于要加入抗生素,費(fèi)用也很高。
滲透壓沖擊和凍結(jié)-融解法都屬于較溫和的方法,但破碎作用較弱,它們只適用于細(xì)胞壁較脆弱的微生物菌體或者細(xì)胞壁合成受抑制、強(qiáng)度減弱了的微生物,它們常與酶解法結(jié)合起來使用,提高破碎效果。
干燥法屬于較劇烈的一種破碎方法,容易引起蛋白質(zhì)或其他組分變性,當(dāng)提取不穩(wěn)定的生化物質(zhì)時(shí),常加入一些試劑進(jìn)行保護(hù),如可加入少量還原劑半胱氨酸、硫基乙醇、亞硫酸鈉等。
選擇破碎方法時(shí),需要考慮下列因素:細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞壁的強(qiáng)度;產(chǎn)物對(duì)破碎條件(溫度、化學(xué)試劑、酶等)的敏感性;要達(dá)到的破碎程度及破碎所必要的速度等,具有大規(guī)模應(yīng)用潛力的生化產(chǎn)品應(yīng)選擇適合于放大的破碎技術(shù)。同時(shí)還應(yīng)把破碎條件和后面的提取步驟結(jié)合起來考慮。在固-液分離中,細(xì)胞碎片的大小是重要因素,太小的碎片很難分離除去,因此,破碎時(shí)既要獲得高的產(chǎn)物釋放率又不能使細(xì)胞碎片太小,如果在碎片很小的情況下才能獲得高的產(chǎn)物釋放率,這種操作條件仍不是合適的,適宜的細(xì)胞破碎條件應(yīng)該從高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后步提取這三方面進(jìn)行權(quán)衡。
為了能有效地破碎細(xì)胞,并盡川能減少產(chǎn)物的破壞,已發(fā)展了多種細(xì)胞破碎的方法通常可分為機(jī)械法和非機(jī)械法兩類。
①,機(jī)械法
常用的機(jī)械破碎方法是基于液相或固相剪切力,這些剪切力可以在高壓勻漿器或機(jī)械驅(qū)動(dòng)的破碎機(jī)如膠質(zhì)磨、珠磨等設(shè)備中獲得。在高壓勻漿器中,進(jìn)入高壓室中的細(xì)胞懸浮液被強(qiáng)迫通過一個(gè)狹窄的小孔,由于產(chǎn)生液相剪切力引起細(xì)胞破碎。在機(jī)械驅(qū)動(dòng)的破碎機(jī)中,剪切力是由細(xì)胞與設(shè)備中的固體表面間的相互作用產(chǎn)生的,這種剪切力場(chǎng)之間的相互作用較復(fù)雜,目前了解得還不夠深入,工程設(shè)計(jì)大多數(shù)靠經(jīng)驗(yàn)。
1, 高壓勻漿器:高壓漿器是用作細(xì)胞破碎的較好的設(shè)備,它是由可產(chǎn)生高壓的正向排代泵和排出閥組成,排出閥具有狹窄的小孔,其大小可以調(diào)節(jié)。細(xì)胞漿液通過止逆閥進(jìn)入泵體內(nèi),在高壓下迫使其在排出閥的小孔中沖擊,并高速撞擊在撞擊環(huán)上,使細(xì)胞得到破碎。在操作方式上,可以采用單次通過勻漿器或多次循環(huán)通過等方式。某些較難破碎的細(xì)胞,如小球菌、鏈球菌、群母菌和乳酸桿菌等,以及處于生長靜止期的細(xì)胞或通入的細(xì)胞濃度較高時(shí),應(yīng)采用多次循環(huán)的方式才能達(dá)到較高的破碎率
2, 高速珠磨機(jī):珠磨是另一種常用的機(jī)械破碎細(xì)胞的方法。利用玻璃小珠與細(xì)胞懸浮液一起快速攪拌,由于研磨作用,使細(xì)胞獲得破碎。
3, 超聲波振蕩器:超聲波具有頻率高、波長短、定向傳播等特點(diǎn),通常在15~25kHz的頻率下操作。超聲波振蕩器有不同的類型,常用的為電聲型,它是由發(fā)聲器和換能器組成,發(fā)生器能產(chǎn)生高頻電流,換能器的作用是把電磁振蕩轉(zhuǎn)換成機(jī)械振動(dòng)。超聲波振蕩器又可分為槽式和探頭直接插入介質(zhì)兩種型式,一般破碎效果后者比前者好。超聲波對(duì)細(xì)胞的破碎作用與液體中空穴的形成有關(guān)。當(dāng)超聲波在液體中傳播時(shí),液體中的某一小區(qū)域交替重復(fù)地產(chǎn)生巨大的壓力和拉力。由于拉力的作用,使液體拉伸而破裂,從而出現(xiàn)細(xì)小的空穴。這種空穴泡在超聲波的繼續(xù)作用下,又迅速閉合,產(chǎn)生一個(gè)極為強(qiáng)烈的沖擊波壓力,由它引起的粘滯性漩渦在懸浮細(xì)胞上造成了剪切應(yīng)力,促使其內(nèi)部液體發(fā)生流動(dòng),而使細(xì)胞破碎。超聲波處理細(xì)胞懸浮液時(shí),破碎作用受許多因素的影響,如超聲波的聲強(qiáng)、頻率、液體的溫度、壓強(qiáng)和處理時(shí)間等,此外介質(zhì)的離子強(qiáng)度、PH值和菌種的性質(zhì)等也有很大的影響。不同的菌種,用超聲波處理的效果也不同,桿菌比球菌易破碎,革蘭氏陰性菌細(xì)胞比革蘭氏陽性菌易破碎,酵母菌效果較差。
②,非機(jī)械法
適合于破碎微生物細(xì)胞的非機(jī)械法有多種,包括化學(xué)法、酶解法、物理法和干燥法等。
1, 化學(xué)法:采用化學(xué)試劑處理微生物細(xì)胞可以溶解細(xì)胞或抽提某些細(xì)胞組分。用堿處理細(xì)胞,可以溶解除去細(xì)胞壁以外的大部分組分。酸處理可以使蛋白質(zhì)水解成游離氨基酸,通常采用6mol/L HCl處理。此外,某些表而活性劑(如洗滌劑)也常能引起細(xì)胞溶解或使某些組分從細(xì)胞內(nèi)滲漏出來,如對(duì)胞內(nèi)的異淀粉酶可加入0.1%十二烷基硫酸鈉或0.4%triton X-100于菌液中,30℃振蕩30小時(shí)就能較完全地將異淀粉酶抽提出來,且酶的比活較機(jī)械破碎法的高。除上述酸、堿及表面活性劑外,也可采用某些脂溶性有機(jī)溶劑,如丁醇、丙酮、氯仿等它們能溶解細(xì)胞膜上的脂質(zhì)化合物,使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞,將胞內(nèi)產(chǎn)物抽提出來。但是,這些溶劑容易引起生化物質(zhì)破壞,使用時(shí)應(yīng)考慮其穩(wěn)定性,操作要在低溫下進(jìn)行,處理后,還必須將抽提液中的有機(jī)溶劑從生化物質(zhì)中分離回收。
2, 酶解法:酶解法是利用酶反應(yīng)分解破壞細(xì)胞壁上特殊的鍵,以達(dá)到破壁的目的。酶解的方法可以在細(xì)胞懸浮液中加入特定的酶,也可采用自溶作用。應(yīng)用酶解需要選擇適宜的酶和酶系統(tǒng),并要控制特定的反應(yīng)條件,某些微生物體可能僅在生長的某一階段或生長處于特定的情況下,對(duì)酶解才是靈敏的。有時(shí),還需附加其他的處理,如輻射,滲透壓沖擊、反復(fù)凍融等或加金屬整合劑 EDTA,除去與膜蛋白結(jié)合的金屬離了,暴露出對(duì)酶解敏感的結(jié)構(gòu)部分,也可利用生物因素以促進(jìn)活性,變得對(duì)酶解作用敏感。
對(duì)于微生物細(xì)胞,常用的酶是菌酶,它能專一的分解細(xì)胞壁上糖蛋白分子的 β(1,4)糖苷鍵,使多糖分解,經(jīng)菌酶處理后的細(xì)胞移至低滲溶液中,細(xì)胞就會(huì)破裂。例如在巨大芽抱桿菌或小球菌懸浮液中加入溶菌酶,很快就產(chǎn)生溶菌現(xiàn)象。除溶菌酶外,還可選用蛋白酶、脂肪酶、核酸酶、透明質(zhì)酸酶等。
自溶作用是利用微生物自身產(chǎn)生的酶來溶菌,而不需外加其他的酶。在微生物代謝過程中,大多數(shù)都能產(chǎn)生一種能水解細(xì)胞壁上聚合物的酶,以便生長過程繼續(xù)下去。有時(shí)改變其生長的環(huán)境,可以誘發(fā)產(chǎn)生過剩的這種酶或激發(fā)產(chǎn)生其它的自溶酶,以達(dá)到自溶目的。影響自溶過程的因素有溫度、時(shí)間、pH、緩沖液濃度、細(xì)胞代謝途徑等。微生物細(xì)胞的自溶常采用加熱法或干燥法。例如,谷氨酸產(chǎn)生菌,可加入0.028mol/L Na2CO3和0.018mol/L NaHCO3 pH10的緩沖液,制成3%的懸浮液,加熱至70℃保溫?cái)嚢?0分鐘,菌體即自溶。又如酵母細(xì)胞的自溶需在45~50℃溫度下保持12~24小時(shí)。
采用抑制細(xì)胞壁合成的方法能導(dǎo)致類似于酶解的結(jié)果。某些抗生素如青霉素或環(huán)絲氨酸等,能阻止新細(xì)胞壁物質(zhì)的合成。但是抑制劑加入的時(shí)間很重要,應(yīng)在發(fā)酵過程中細(xì)胞生長的后期加入,只有當(dāng)抑制劑加入后,生物合成和再生還在繼續(xù)進(jìn)行,溶胞的條件才是有利的,因?yàn)樵诩?xì)胞分裂階段,細(xì)胞壁就造成缺陷,即達(dá)到溶胞作用。
3, 滲透壓沖擊法:先把細(xì)胞放在高滲溶液中(例如一定濃度的甘油或蔗糖溶液)由于滲透壓的作用,細(xì)胞內(nèi)水分便向外滲出,細(xì)胞發(fā)生收縮,當(dāng)達(dá)到平衡后,將介質(zhì)快速稀釋或?qū)⒓?xì)胞轉(zhuǎn)入水或緩沖液中,由于滲透壓發(fā)生突然變化,胞外的水分迅速滲入胞內(nèi),使細(xì)胞快速膨脹而破裂。
4, 凍結(jié)-融化法:將細(xì)胞放在低溫下冷凍(約-15℃),然后在室溫中融化,如此反復(fù)多次,就能使細(xì)胞壁破裂。凍結(jié)-融化法破壁的機(jī)理有兩方面:一方面在冷凍過程中會(huì)促使細(xì)胞膜的疏水鍵結(jié)構(gòu)破裂,從而增加細(xì)胞的親水性能。另一方面,冷凍時(shí)胞內(nèi)水結(jié)晶,形成冰晶粒,引起細(xì)胞膨脹而破裂。
5, 干燥法:經(jīng)干燥后的菌體,其細(xì)胞膜的滲透性發(fā)生變化,同時(shí)部分菌體會(huì)產(chǎn)生自溶,然后用丙酮、丁醇或緩沖液等溶劑處理時(shí),胞內(nèi)物質(zhì)就會(huì)被抽提出來。
干燥法的操作可分空氣干燥、真空干燥、噴霧干燥和冷凍干燥等。酵母菌常用空氣干燥,在25~30℃的熱空氣流中吹干,部分酵母產(chǎn)生自溶,再用水,緩沖液或其他溶劑抽提時(shí),效果就較好。真空干燥適用于細(xì)菌,把干燥成塊的菌體磨碎再進(jìn)行抽提。冷凍干燥適用于制備不穩(wěn)定的生化物質(zhì),在冷凍條件下磨成粉,再用緩沖液抽提。
四,各種破碎方法的優(yōu)劣和選擇依據(jù)
由上述可見,細(xì)胞破碎的方法很多,但是它們的破碎效率和適用范圍不同。其中許多方法僅適用于實(shí)驗(yàn)室和小規(guī)模的破碎,迄今為止,能適用于工業(yè)化的大規(guī)模破碎方法還很少,由于高壓勻漿和珠磨兩種機(jī)械破碎方法,處理量大,速度非常快,目前在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用最廣泛。
在機(jī)械法破碎過程中,由于消耗機(jī)械能而產(chǎn)生大量的熱量,使料液溫度升高,而易造成生化物質(zhì)的破壞,這是機(jī)械法破碎中存在的共同問題,因此,在大多數(shù)情況下都要采取冷卻措施,對(duì)于較小的設(shè)備,可采用冷卻夾套或直接投入冰塊冷卻,但是在大型設(shè)備中熱量的除去是必須考慮的一個(gè)主要問題。特別在超聲波處理時(shí),熱量的驅(qū)散不太容易,很容易引起介質(zhì)溫度的迅速上升,這就限制了它的放大使用,因?yàn)橐斎牒芨叩哪軄硖峁┍匾睦鋮s,在經(jīng)濟(jì)上是不合算的。因此,超聲波振蕩法主要適用于實(shí)驗(yàn)室或小規(guī)模的細(xì)胞破碎。
非機(jī)械法中的化學(xué)法和酶法應(yīng)用最廣泛。采用化學(xué)法時(shí),特別應(yīng)注意的問題是所選擇的溶劑(酸、堿、表面活性劑和有機(jī)溶劑等)對(duì)生化物質(zhì)不能具有損害作用,在操作后,還必須采用常規(guī)的分離手段,從產(chǎn)物中除去這些試劑,以保證產(chǎn)品的純凈。酶解法的優(yōu)點(diǎn)是專一性強(qiáng),發(fā)生酶解的條件溫和,采用該法時(shí)必須選擇好特定的酶和適宜的操作條件。由于溶菌酶價(jià)格較高,一般僅適用于小規(guī)模應(yīng)用。但是對(duì)于酵母細(xì)胞壁的破碎,已有應(yīng)用于工業(yè)規(guī)模的報(bào)道。自溶法價(jià)格較低,在一定程度上能用于工業(yè)規(guī)模,但是,對(duì)不穩(wěn)定的微生物容易引起所需蛋白質(zhì)的變性,自溶后的細(xì)胞培養(yǎng)液過濾速度也會(huì)降低。抑制細(xì)胞壁合成的方法由于要加入抗生素,費(fèi)用也很高。
滲透壓沖擊和凍結(jié)-融解法都屬于較溫和的方法,但破碎作用較弱,它們只適用于細(xì)胞壁較脆弱的微生物菌體或者細(xì)胞壁合成受抑制、強(qiáng)度減弱了的微生物,它們常與酶解法結(jié)合起來使用,提高破碎效果。
干燥法屬于較劇烈的一種破碎方法,容易引起蛋白質(zhì)或其他組分變性,當(dāng)提取不穩(wěn)定的生化物質(zhì)時(shí),常加入一些試劑進(jìn)行保護(hù),如可加入少量還原劑半胱氨酸、硫基乙醇、亞硫酸鈉等。
選擇破碎方法時(shí),需要考慮下列因素:細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞壁的強(qiáng)度;產(chǎn)物對(duì)破碎條件(溫度、化學(xué)試劑、酶等)的敏感性;要達(dá)到的破碎程度及破碎所必要的速度等,具有大規(guī)模應(yīng)用潛力的生化產(chǎn)品應(yīng)選擇適合于放大的破碎技術(shù)。同時(shí)還應(yīng)把破碎條件和后面的提取步驟結(jié)合起來考慮。在固-液分離中,細(xì)胞碎片的大小是重要因素,太小的碎片很難分離除去,因此,破碎時(shí)既要獲得高的產(chǎn)物釋放率又不能使細(xì)胞碎片太小,如果在碎片很小的情況下才能獲得高的產(chǎn)物釋放率,這種操作條件仍不是合適的,適宜的細(xì)胞破碎條件應(yīng)該從高的產(chǎn)物釋放率、低的能耗和便于后步提取這三方面進(jìn)行權(quán)衡。
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