摘 要： 建立柱前衍生-高效液相色譜（HPLC）聯(lián)合紫外檢測分析方法測定冰乙酸中微量乙酸酐的含量。樣品采用嗎啡啉為柱前衍生劑，色譜柱為Atlantis T3（250 mm×4.6 mm， 5 μm），以磷酸水溶液（pH 3.0）-甲醇（體積比為95∶5） 為流動相，流量為1.0 mL/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為210 nm。乙酸酐的質量濃度在2.60~25.97 μg/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數(shù)為0.999 9，檢出限為0.8 μg/mL，定量限為3 μg/mL。平均樣品加標回收率為92.8%~99.2%，測定結果的相對標準偏差為0.9%~2.3%（n=6）。該方法可用于冰乙酸中微量乙酸酐的含量測定。

關鍵詞： 嗎啡啉； 乙酸酐； 冰乙酸； 柱前衍生； 高效液相色譜法

 

冰乙酸是一種有機一元酸，具有強烈刺激性氣味，在試劑分析、非水滴定等方面運用廣泛，同時冰乙酸是一種重要的有機合成原料，多應用于醋酸纖維、農藥、醫(yī)藥、染料等生產行業(yè)[1?3]。目前，乙酸的工業(yè)制備方法主要為甲醇低壓羰基合成法、丁烷氧化法和乙醛氧化法[4]。由于生產工藝的差異，乙酸中的雜質也多種多樣，GB/T 676—2007 《化學試劑 乙酸(冰醋酸)》顯示冰乙酸中常含有乙酸酐、重金屬、硫酸鹽等雜質。

乙酸酐，又名乙酐或醋酐，其分子結構是由兩分子乙酸失去一分子水而形成的酸酐，可用作溶劑、脫水劑和聚合物引發(fā)劑。此外，乙酸酐還是一種比較活潑的乙酰化試劑，能與醇、酚和胺等形成乙酸酯和乙酰胺類化合物[5?7]，常用于生產纖維素乙酸酯、醫(yī)藥、農藥和香料等。由于冰乙酸中乙酸酐含量過多，可能導致后續(xù)合成產品中存在較多小分子副產物，在醫(yī)藥領域中，會增大未知雜質的產生風險，降低原料藥或制劑的質量，因此對冰乙酸中乙酸酐含量的測定在藥品研發(fā)中具有重要的研究意義。

國內外檢測乙酸及其衍生物的研究文獻較多[8?12]，但大多不適用于檢測乙酸酐，目前檢測酸酐類化合物的方法主要有比色法[13]、化學滴定法[14]和氣相色譜法[15?18]。其中，比色法是通過在酸性條件下反應生成紅色的異羥肟酸鐵的方法來測定酸酐含量，操作步驟繁瑣，高氯酸具有刺激性、強腐蝕性等特點，且人工目視比色的準確度相對于儀器分析的誤差比較大；化學滴定法的原理是利用酸酐水解生成酸，與堿性標準溶液反應來測定其含量，該方法檢出限較高，指示劑變色的敏銳程度和用量直接影響定量結果，重現(xiàn)性較差，而且樣品中若含有其他酸性化合物，易對測定結果造成干擾；在使用氣相色譜法時，如果樣品自身結構比較復雜，需要開發(fā)特殊的前處理方式，耗時且費用成本較高。此外，高溫易導致有機酸脫水生成酸酐，造成酸酐測試誤差[19]。近年來，報道用液相色譜方法檢測乙酸酐的文章極少，楊成鈺等[20]利用二甲胺衍生高效液相色譜（HPLC）法測定嗎啉噁酮中殘留的少量乙酸酐，但是該方法的衍生條件操作復雜，試劑種類較多，二氯甲烷毒害性強且易揮發(fā)。建立一種用于檢測冰乙酸中乙酸酐的既簡單易操作又可靠環(huán)保的樣品前處理方法是十分必要的。

筆者根據(jù)嗎啡啉與乙酸酐易反應生成乙酰嗎啉[19]的原理，首次提出了以嗎啡啉作為衍生化試劑的柱前衍生化HPLC法，該方法衍生效率高、重復性好、快速且定量準確，適用于測定冰乙酸中微量乙酸酐的含量，從而達到控制冰乙酸的產品質量，為藥品研發(fā)工作提供指導性建議。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：1260型，帶有紫外-可見檢測器，美國安捷倫科技有限公司。

多參數(shù)測試儀：S975型，測量精度為0.01，瑞士梅特勒-托利多有限公司。

分析天平：MSA225S-1CE-DA型，感應量為0.01 mg，德國賽多利斯集團。

乙酸酐：純度（質量分數(shù)）為98.5%，批號為20210820，上海凌峰化學試劑有限公司。

嗎啡啉：純度（質量分數(shù)）為99.0%，批號為F181208，上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

乙腈、甲醇：均為色譜純，天津市康科德科技有限公司。

磷酸、氫氧化鈉：均為分析純，上海國藥集團化學試劑有限公司。

冰乙酸：色譜純，批號為K54173956210，德國默克公司。

實驗用水：超純水，由密理博純水儀制得。

1.2 色譜條件

色譜柱：Waters Atlantis T3柱（250 mm×4.6 mm, 5 μm，美國沃特世公司）；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：210 nm；進樣體積：40 μL；柱溫：30 ℃；流動相：甲醇-pH為3.0磷酸水溶液（體積比為5∶95）；流量：1.0 mL/min；洗脫方式：等度洗脫。

1.3 實驗步驟

1.3.1 溶液配制

磷酸水溶液：于1 000 mL水中加入磷酸0.7 mL，用飽和氫氧化鈉溶液調節(jié)pH值至3.0。

嗎啡啉衍生劑：取嗎啡啉適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋成質量濃度為50 mg/mL的溶液。

空白溶液：精密量取1.0 mL乙腈，置于20 mL量瓶中，加嗎啡啉衍生劑0.5 mL，室溫下衍生1 min，加磷酸水溶液稀釋至標線，搖勻。

對照品儲備液：取乙酸酐適量，精密稱定，加乙腈溶解并定量稀釋成質量濃度為625 μg/mL的溶液，作為對照品儲備液1；精密量取1.0 mL對照品儲備液1，置50 mL量瓶中，用乙腈稀釋至標線，搖勻，作為對照品儲備液2。

對照品溶液：精密量取1.0 mL對照品儲備液2，置20 mL量瓶中，加嗎啡啉衍生劑0.5 mL，室溫下衍生1 min，加磷酸水溶液稀釋至標線，搖勻。

樣品溶液：取0.5 g冰乙酸，精密稱定，置于20 mL量瓶中，加入嗎啡啉衍生劑0.5 mL，混勻后室溫下衍生1 min，加磷酸水溶液稀釋至標線，搖勻，用0.22 μm 針頭式濾膜過濾，取濾液作為樣品溶液。

1.3.2 定量方法

取上述溶液，按照1.2色譜條件進樣分析，記錄色譜峰峰面積，然后按照外標法計算樣品中的乙酸酐含量。

 

2、 結果與討論

 

2.1 色譜柱的選擇

分別選擇Waters Atlantis T3柱 和XSelect HSS T3柱兩種色譜柱進行試驗，結果發(fā)現(xiàn)，衍生產物附近均無干擾峰，說明在相同的測試條件下，選擇T3類色譜柱可滿足測試要求，實驗室可根據(jù)實際情況選擇色譜柱。

2.2 色譜條件的篩選

分別考察0.9、1.0、1.1 mL/min 3種流量條件下的分離效果，結果表明，在不同流量下，除了乙酸酐衍生物的保留時間有變化外，信號響應、分離度、拖尾因子和理論板數(shù)等均無明顯變化，故選擇常用流速1.0 mL/min。

考察柱溫分別為25、30、35 ℃時對測定結果的影響，結果顯示，隨著柱溫的升高，乙酸酐衍生物的保留時間從17.6 min縮短至15.4 min，變化趨勢不大。當柱溫為35 ℃時，目標峰與相鄰雜質的分離度略有減小；當柱溫為25 ℃和30 ℃時，色譜峰峰形對稱，分離良好，拖尾因子為1.0～1.1，理論板數(shù)均大于12 000。由于25 ℃柱溫對實驗室控溫要求較高，因此選擇30 ℃作為最優(yōu)條件。

2.3 衍生條件選擇

2.3.1 衍生反應時間

分別選擇在0.5、1、30、60、120、180 min條件下進行衍生試驗，加標樣品中乙酸酐衍生物的峰面積依次為110 623、109 150、107 191、105 742、105 209、108 252，結果表明在0.5 min內衍生反應已完全，為方便計時，反應時間選擇1 min。

2.3.2 衍生反應溫度

考察衍生反應溫度分別為10、25、60 ℃時對衍生反應的影響，結果顯示加標樣品中乙酸酐衍生物的峰面積無明顯變化，說明溫度對衍生反應影響不大，為方便操作，選擇室溫作為衍生乙酸酐的反應溫度。

2.3.3 衍生劑用量

衍生試劑用量可能會對衍生結果產生影響，因此評估不同嗎啡啉衍生劑用量（0.05、0.1、0.5、1、2、3.5 mL）對衍生反應的效果。測定結果表明，衍生劑用量不同時，加標樣品中乙酸酐衍生物的峰面積無明顯變化，說明當衍生劑用量為0.05 mL時，反應已完全，為避免較小取樣體積引起的結果偏差，衍生劑的用量選用0.5 mL。

2.4 色譜圖

在1.2色譜條件下，分別對空白溶液、對照品溶液、樣品溶液及加標樣品溶液進行測定，4種溶液的高效液相色譜圖見圖1～圖4。由圖1～圖4可知，在空白溶液色譜圖中，目標峰附近無干擾峰。在對照品溶液和加標樣品溶液色譜圖中，乙酸酐衍生物的保留時間為16.8 min，色譜峰峰形尖銳、對稱，分離良好。

圖1   空白溶液色譜圖

Fig. 1   Chromatogram of blank solution

t/min

 

圖2   對照品溶液色譜圖

Fig. 2   Chromatogram of standard solution

t/min

 

圖3   樣品溶液色譜圖

Fig. 3   Chromatogram of sample solution

t/min

 

圖4   加標樣品溶液色譜圖

Fig. 4   Chromatogram of spiked sample solution

t/min

 

2.5 線性方程

分別精密量取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL對照品儲備溶液1，置于50 mL量瓶中，用乙腈稀釋至標線，搖勻，作為線性儲備液，再按照對照品溶液配制方法分別進行衍生化反應，得乙酸酐衍生物系列標準工作溶液，按1.2色譜條件測定。以線性儲備液中乙酸酐的質量濃度(x，μg/mL)為橫坐標，色譜峰面積(y)為縱坐標，繪制標準工作曲線。乙酸酐的質量濃度在2.60～25.97 μg/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，線性方程y=8 093.257 2x-1 860.365 9，相關系數(shù)(r)為0.999 9。

2.6 定量限及檢出限

取對照品儲備液2逐步稀釋至一定濃度后進行衍生，按1.2色譜條件進行測定，記錄峰高，當乙酸酐衍生物信噪比為10時，得到該方法的定量限濃度為3 μg/mL，當乙酸酐衍生物信噪比為3時，得到該方法的檢出限濃度為0.8 μg/mL。

2.7 樣品加標回收與精密度試驗

在冰乙酸樣品中分別加入2.60、6.49、12.98、19.48 μg/mL 4種質量濃度水平的乙酸酐溶液進行加標回收試驗，進行衍生化反應后按1.2色譜條件進行測定，試驗結果見表1。由表1可知，樣品加標平均回收率為92.8%～99.2%，測定結果的相對標準偏差(RSD)為0.9%～2.3%(n=6)，表明該方法具有較高的準確度和較好的精密度，滿足實際樣品的測定要求。

表1   樣品加標回收與精密度試驗結果

Tab. 1   Sample spiking recovery and precision test results

 

2.8 溶液穩(wěn)定性

取冰乙酸0.5 g，精密稱定，置于20 mL量瓶中，精密加入12.98 μg/mL的乙酸酐溶液1.0 mL，加入嗎啡啉衍生劑0.5 mL，混勻后室溫下衍生1 min，加入磷酸水溶液稀釋至標線，搖勻，分別于室溫下放置0、20、48、72 h后按照1.2色譜條件進行測定，記錄色譜峰面積，穩(wěn)定性試驗結果見表2。由表2可知，衍生產物的色譜峰面積無明顯變化，測定結果的相對標準偏差為0.62%，表明該衍生產物在室溫下放置72 h內具有良好的穩(wěn)定性，在此期間可進行進一步的定量分析研究。

表2   穩(wěn)定性試驗結果

Tab. 2   Results of stability test

 

3、 結論

 

由于樣品基質成分簡單，干擾較少，測定單一組分乙酸酐衍生物所需時間略長。

理論上，衍生化反應溫度、時間和衍生劑的用量對衍生化反應均有影響，但單因素試驗結果顯示反應溫度、時間和衍生劑用量對衍生反應影響較小，故不再進行正交試驗篩選最佳反應條件。

建立了以嗎啡啉為衍生化試劑，柱前衍生化高效液相色譜測定冰乙酸中微量乙酸酐含量的檢測方法，考察了該方法的精密度、加標回收率和定量限，結果表明該方法精密度高、回收率良好、反應條件溫和、基質干擾小、成本低且靈敏度高，適用于冰乙酸中乙酸酐的質量控制。

 

 

 

參考文獻：

1 何雙榮. 醋酸生產技術及對比［J］. 化工設計通訊，2024，50（1）：22.

    HE Shuangrong. Production technology and comparison for acetic acid［J］. Chemical Engineering Design Communications， 2024，50（1）：22.

 

2 杜曉宇，郝金明. 我國醋酸的生產現(xiàn)狀及發(fā)展建議［J］. 天津化工，2024，38（2）：7.

    DU Xiaoyu，HAO Jinming. The production status and development suggestions of acetic acid in China［J］. Tianjin Chemical Industry， 2024， 38（2）：7.

 

3 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典（2020年版）［M］. 4部. 北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.

    NATIONAL PHARMACOPOEIA COMMISSION. Pharmacopoeia of the People's republic of China（2020 edition）［M］. Part 4. Beijing：China Medical Science and Technology Press， 2020.

 

4 黃煜，葛立新. 工業(yè)冰乙酸國內外試驗方法的研究及驗證［J］. 化工技術與開發(fā)，2020，49（5）：46.

    HUANG Yu，GE Lixin. Study and validation of industrial glacial acetic acid test methods in China and abroad［J］. Technology & Development of Chemical Industry， 2020， 49（5）：46.

 

5 BUVÁRI-BARCZA A，TÓTH I，BARCZA L. Anhydrous formic acid and acetic anhydride as solvent or additive in nonaqueous titrations ［J］. Die Pharmazie， 2005， 60（9）：650.

 

6 周永升，張思原，龍勇益，等. 響應面法優(yōu)化蔗葉纖維素乙酸酯的制備工藝［J］. 甘蔗糖業(yè)， 2022， 51（1）：47.

    ZHOU Yongsheng， ZHANG Siyuan， LONG Yongyi，et al. Optimization of preparation process of cellulose acetate from sugarcane leaves by response surface methodology［J］. Sugarcane and Canesugar， 2022， 51（1）：47.

 

7 安建華，韋紅映，陳潔. 三甲基乙酸酐衍生氣相質譜檢測空氣中乙二胺的方法［J］. 山西化工， 2023， 43（12）：47.

    An Jianhua，Wei Hongying，Cheng Jie. Trimethylacetic anhydride-derived gas phase mass spectrometry method for the detection of ethylenediamine in air［J］. Shanxi Chemical Industry，2023，43（12）：47.

 

8 彭曉鯤，黃小芳，肖慧，等.氣相色譜法測定白酒中的乙酸、己酸含量［J］. 實驗室檢測，2024，2（1）：17.

    PENG Xiaokun，HUANG Xiaofang，XIAO Hui，et al. Determination of acetic acid and hexanoic acid in Chinese liquor by gas chromatography［J］. Laboratory Testing， 2024， 2（1）：17.

 

9 劉佳銘，王會寧，王嘉林，等. 高效液相色譜法測定脫氫乙酸色譜條件綜述［J］. 化學分析計量，2023，32（5）：103.

    LIU Jiaming，WANG Huining，WANG Jialin，et al. Summary of chromatographic conditions for the determination of dehydroacetic acid by high performance liquid chromatography［J］. Chemical Analysis and Meterage， 2023， 32（5）：103.

 

10 JI M M，ZHONG Y H，LI M，et al. Determination of acetic acid in enzymes based on the cataluminescence activity of graphene oxide-supported carbon nanotubes coated with NiMn layered double hydroxides［J］. Mikrochim Acta， 2023， 190（6）：231.

 

11 趙璇，趙漢鷹，許迎子，等. 測定白酒中乳酸和乙酸含量的方法［J］. 釀酒， 2023， 50（5）：120.

    ZHAO Xuan，ZHAO Hanying，XU Yingzi，et al. Development of methods for determining the content of lactic acid and acetic acid in baijiu［J］. Liquor Making， 2023， 50（5）：120.

 

12 王禹衡，張婧文，鄭洪國，等. 快速溶劑萃取-離子色譜-質譜法測定人體血液、尿液中的氟乙酸色譜［J］. 色譜，2023，41（6）：497.

    WANG Yuheng，ZHANG Jingwen，ZHENG Hongguo，et al. Determination of fluoroacetic acid in human blood and urine by accelerated solvent extraction-ion chromatography-mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Chromatography，2023，41（6）：497.

 

13 張松，張曉斌，張仕君，等. 乙酸中微量乙酸酐的檢測方法：CN 108827950［P］. 2018.

    ZHANG Song，ZHANG Xiaobin，ZHANG Shijun，et al. A testing method for trace amounts of acetic anhydride in acetic acid：CN 108827950 ［P］. 2018.

 

14 曹宗澤，姬定西，劉明杰，等. 非水滴定法測定易水解酸酐的游離酸［J］. 廣東化工，2019，46（5）：204.

    CAO Zongze，JI Dingxi，LIU Mingjie，et al. Determination of free acids in hydrolytic anhydrides by the non-aqueous titration method ［J］. Guangdong Chemical Industry，2019，46（5）：204.

 

15 唐一林，孟海波，孟漢卿，等. 氣相色譜內標法測定反應液中醋酐和吡啶的方法：CN 102288699［P］. 2011.

    TANG Yilin，MENG Haibo，MENG Hanqing，et al. Gas chromatography internal standard method for the determination of acetic anhydride and pyridine reaction solution methods：CN 102288699 ［P］. 2011.

 

16 黃佳雯，梁佳威，景曉寧，等. 氣相色譜法測定乙酰氨基酚原料乙酸酐中雜質丙酸酐殘留量研究［J］. 天津化工，2020，34（5）：41.

    HUANG Jiawen，LIANG Jiawei，JING Xiaoning，et al. A gas chromatographic method for determination of propionic anhydride residues in acetic anhydride［J］. Tianjin Chemical Industry，2020，34（5）：41.

 

17 牛靜靜，王世平，杜亞珍. 氣相色譜法測定聚異丁烯丁二酸酐中游離酸酐［J］. 化學分析計量，2024，33（3）：65.

    NIU Jingjing，WANG Shiping，DU Yazhen. Determination of free anhydride in polyisobutylene succinic anhydride by gas chromatography［J］. Chemical Analysis and Meterage，2024，33（3）：65.

 

18 丁新燕，周吉，王偉，等. 氣相色譜法測定鄰苯二甲酸酐純度的測量不確定度評定［J］. 計量學報，2022，43（9）：1 236.

    DING Xinyan， ZHOU Ji，WANG Wei，et al. Evaluation of uncertainty in measurement of purity of phthalic anhydride by gas chromatography［J］. Acta Metrologica Sinica，2022，43（9）：1 236.

 

19 盧喬森，黃韻弘，黃超明，等. 酰化嗎啉生產技術及其應用進展［J］. 應用化工，2016，45（8）：1 566.

    LU Qiaosen，HUANG Yunhong，HUANG Chaoming，et al. Progress of production and application of N-acylated morpholine［J］. Applied Chemical Industry，2016，45（8）：1 566.

 

20 楊成鈺，汪欽標. HPLC法測定嗎啉噁酮中殘留的醋酸和醋酐的含量［J］. 輕工科技，2012（2）：104.

    YANG Chengyu，WANG Qinbiao. Determination of residual acetic acid and acetic anhydride in morpholinonone by HPLC ［J］. Light Industry Science and Technology，2012（2）：104.

 

引用本文： 王錦，黃哲，曹婉，等 . 柱前衍生-高效液相色譜法測定冰乙酸中微量乙酸酐［J］. 化學分析計量，2024，33（8）：69. (WANG Jin, HUANG Zhe, CAO Wan, et al. Determination of acetic anhydride in glacial acetic acid by HPLC with pre-column derivatization[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(8): 69.)