摘 要： 建立高效液相色譜法在不同檢測波長處同時測定阿咖酚散/膠囊中3種主要雜質成分水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺的含量。采用Ultimate LP-C18 （150 mm×4.6 mm， 5 µm）色譜柱，進行多波長分析。流動相為磷酸鹽緩沖液（0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調節pH值至2.6±0.1）-甲醇（7∶3），水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺檢測波長分別為241、263、254 nm，流量為0.9 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣體積為20 µL。3種雜質的質量濃度在各自范圍內與色譜峰面積的線性關系良好，相關系數均為0.999 8，定量限為0.03~0.14 µg/mL。樣品加標平均回收率為97.7%～102.3%，測定結果的相對標準偏差均小于3.0%（n=6）。該法可用于阿咖酚散/膠囊中3種主要雜質成分的含量測定。

關鍵詞： 多波長； 高效液相色譜法； 阿咖酚散/膠囊； 雜質檢測

 

阿咖酚散/膠囊作為常用的感冒藥，內容物主要為每粒含阿司匹林230 mg、對乙酰氨基酚126 mg、咖啡因30 mg和輔料適量的復方制劑。因其價格便宜在市場上流通廣泛，臨床上主要用于解熱鎮痛[1]。由于生產阿咖酚散/膠囊的廠家較多，簡單的包裝在生產、運輸、儲存中可能產生降解雜質。目前實施的質量標準有國家食品藥品監督管理局國家藥品標準WS-10001-(HD-0941)-2002和YBH 01232010，其中，檢查項只對阿司匹林的降解產物游離水楊酸進行雜質控制，而對主成分對乙酰氨基酚中可能存在的降解產物對氨基酚、對氯苯乙酰胺未建立限度檢查[2?3]。由于對氨基酚、對氯苯乙酰胺等雜質成分具有遺傳毒性、腎毒性等[4?5]，對人體健康存在一定隱患，且阿咖酚散/膠囊的現行標準對雜質水楊酸的檢查方法不同、限度（散劑為2.0%，膠囊劑為3.0%）控制不同。

筆者通過文獻研究[6?14]發現阿咖酚散/膠囊的質量控制不夠全面準確、雜質檢查方法不一，故建立了多波長高效液相色譜法[15]同時檢測阿咖酚散/膠囊中3種主要雜質成分的含量，能夠快速準確地進行定量檢測，為阿咖酚散/膠囊的雜質控制及質量標準提升提供依據。

 

1、 實驗部分

 

1.1 主要儀器和試劑

高效液相色譜儀：LC-20AT型，日本島津公司。

紫外分光光度計：UV-2700型，日本島津公司。

超聲波清洗器：KQ-500E型，昆山市超聲儀器有限公司。

電子天平：XS205DU型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超低溫冷凍儲存箱：DW-FL450型，中科美菱低溫科技有限公司。

甲醇、乙腈：均為色譜純，美國默克密理博公司。

磷酸：優級純，國藥集團化學試劑（北京）有限公司。

磷酸二氫鉀：分析純，國藥集團化學試劑（北京）有限公司。

阿咖酚散/膠囊：共11批，樣品信息及生產廠家見表1。

表1   樣品信息及生產廠家

Tab. 1   Sample information and manufacturer

 

水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺標準品：純度（質量分數）分別為99.8%、98.2%、100.0%，批號分別為100106-202106、100802-202306、100850-202304，中國食品藥品檢定研究院。

實驗用水：超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：Ultimate LP-C18 柱(150 mm×4.6 mm, 5 µm，美國Welch公司)；柱溫：30 ℃；進樣體積：20 µL；流動相：A相為磷酸鹽緩沖液（取0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液，用磷酸調解pH值至2.6±0.1），B相為甲醇，等度洗脫，流量為0.9 mL/min；液相洗脫方法見表2。

表2   液相洗脫方法

Tab. 2   Elution method of HPLC

 

 

1.3 溶液制備

1.3.1 混合對照品溶液

在避光條件下分別精密稱取水楊酸標準品54.06 mg、對氨基酚標準品8.02 mg、對氯苯乙酰胺標準品4.05 mg，置于同一20 mL棕色量瓶中，加入甲醇適量，振搖使其溶解，并定容至標線，作為混合標準儲備液。

精密量取混合標準儲備液5 mL，置于同一100 mL棕色容量瓶中，加甲醇稀釋并定容至標線，搖勻，作為混合標準溶液。

1.3.2 系列混合標準工作溶液

精密量取混合標準儲備液適量，用甲醇稀釋成系列混合標準工作溶液，其中水楊酸的質量濃度分別為270.30、135.15、67.58、33.79、16.89、3.38、0.68 µg/mL，對氨基酚的質量濃度分別為40.10、20.05、10.02、5.01、2.51、0.50、0.10 µg/mL，對氯苯乙酰胺質量濃度分別為20.25、10.12、5.06、2.53、1.26、0.25、0.05 µg/mL。

1.3.3 樣品溶液

在避光條件下，取《中華人民共和國藥典》2020年版四部“通則0115散劑”中“裝量差異”項下內容物（10袋共含阿司匹林2 300 mg、對乙酰氨基酚1 260 mg、咖啡因300 mg和輔料適量的復方制劑，批號為230101），混合均勻，精密稱取適量（約相當于對乙酰氨基酚100 mg），置于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇適量，超聲溶解后，定容至標線，搖勻濾過，作為樣品溶液。

1.3.4 加標樣品溶液

在避光條件下，取《中華人民共和國藥典》2020年版四部“通則0115散劑”中“裝量差異”項下內容物，混合均勻，精密稱取適量（約相當于對乙酰氨基酚100 mg），置于10 mL棕色容量瓶中（平行取樣18份），分別精密加入混合對照品儲備液2.0、2.5、3 mL各6份，再加入甲醇，定容至標線，搖勻，濾過。

1.3.5 空白溶液

以甲醇作為空白溶液。所有溶液均在-30°C超低溫冷凍儲存箱下儲存。

1.4 實驗方法

取表1中不同生產廠家的11批樣品按1.3.3方法制備樣品溶液，每批各2份，再按照1.2色譜條件進樣測定，利用標準工作曲線外標法計算3種雜質成分的含量，水楊酸含量按阿司匹林標示量的百分比計算，對氨基酚及對氯苯乙酰胺含量按對乙酰氨基酚標示量的百分比計算，得到3種雜質的測得量（質量分數）見表3。

表3   樣品雜質含量（質量分數）測定結果

Tab. 3   Determination results of impurity content (mass fraction) in the sample ( % )

注：“-”表示未檢測出。

 

2、 結果與討論

 

2.1 測定波長及溶劑選擇

經紫外分光光度計全波長掃描，發現水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺在240～270 nm波長處有最大吸收，經液相色譜進樣比較系統適用性參數后選擇測定波長分別為241、263、254 nm，各待測成分峰形、響應值和分離度均較好。對比國家食品藥品監督管理局國家藥品標準WS-10001-(HD-0941)-2002和YBH 01232010中單波長等度檢測，結果發現采用多波長法切換檢測條件下，各成分系統適用性參數更佳，因此選擇多波長法。

分別考察了甲醇、乙醇、水作為溶劑對測定結果的影響。結果發現甲醇作為溶劑時，樣品在1 min內超聲能夠完全溶解，而乙醇、水作為溶劑時樣品超聲較難溶解。溶解時間長可能會增加阿司匹林水解，導致雜質水楊酸含量增大，因此采用甲醇作為溶劑，結果發現樣品峰形等各項色譜參數均符合測定要求。

2.2 流動相及柱溫選擇

考察磷酸鹽緩沖液在不同pH值下（pH值分別為2.0、2.4、2.6、3.0）與甲醇配制的流動相，發現pH＜2.6時，對氨基酚與對乙酰氨基酚色譜峰重疊，pH=3.0時，水楊酸的穩定性不佳，因此選擇磷酸鹽緩沖液pH=2.6。考察不同比例的流動相及0.8、0.9、1.0 mL/min的進樣流量，結果發現磷酸鹽緩沖液-甲醇（7∶3）、流量0.9 mL/min的條件下，各待測成分分離度最佳。通過比較不同柱溫下（25、30、35 ℃）混合對照品溶液中各待測物峰面積響應及理論塔板數，結果見表4。

表4   不同柱溫下各成分的峰面積及理論塔板數

Tab. 4   Sample impurity content determination results

由表4可知，柱溫為30 ℃時各待測成分峰面積及理論塔板數最大，因此選擇柱溫為30 ℃。

2.3 專屬性

取空白溶液、混合對照品溶液、加標樣品溶液、樣品溶液按照1.2色譜方法進樣，色譜圖分別見圖1~圖4。由圖4可知，各成分專屬性強，其他原輔料成分不影響各待測物質的含量測定。對氨基酚、水楊酸、對氯苯乙酰胺先后出峰，理論塔板數均大于2 000，分離度均大于2.0。

圖1   空白溶液色譜圖

Fig. 1   Chromatogram of blank control solution

t/min

 

圖4   樣品溶液色譜圖

Fig. 4   Chromatogram of sample solution

1—對氨基酚；2—水楊酸

t/min

 

 

  1—對氨基酚；2—水楊酸；3—對乙酰氨基酚圖2　混合對照品溶液色譜圖

Fig. 2   Chromatogram of mixed standard solution

t/min

 

 

  1—對氨基酚；2—水楊酸；3—對乙酰氨基酚圖3　加標樣品溶液色譜圖

Fig. 3   Chromatogram of spiked sample solution

t/min

 

2.4 線性關系與定量限

按照1.2色譜方法測定系列混合標準工作溶液。以質量濃度（x）為橫坐標，色譜峰面積（y）為縱坐標繪制標準工作曲線，利用加權最小二乘法進行回歸運算。以信噪比為10作為各成分的定量限。3種雜質成分的線性范圍、線性方程、相關系數及定量限見表5。由表5可知，水楊酸、對氨基酚、對氯苯乙酰胺的質量濃度在各自范圍內與色譜峰面積具有良好的線性關系，相關系數均為0.999 8，定量限分別為0.14、0.05、0.03 µg/mL，表明該方法具有較高的靈敏度，適于定量。

表5   線性回歸方程及定量限結果

Tab. 5   Linear regression equation and quantitative limit results

 

 

2.5 穩定性試驗

取1.3.3中含混合標準儲備液2.0 mL的加標樣品溶液，于室溫條件下分別避光放置0、2、4、6、8 h，在1.2色譜條件下進樣測定，記錄色譜峰面積并帶入線性方程計算各成分的質量濃度，試驗結果見表6。由表6可知，樣品溶液中雜質水楊酸隨阿司匹林降解含量逐漸增加；對氨基酚在4 h內較為穩定，超過4 h后含量逐漸降低；對氯苯乙酰胺在8 h內穩定，測定結果的相對標準偏差小于3.0%，因此樣品測定時應臨用現配，配制時間控制在2 h以內并立刻進樣。

表6   穩定性試驗結果

Tab. 6   Stability test results

 

2.6 樣品加標回收率與精密度試驗

在避光條件下，選取已知濃度的加標樣品溶液，按照1.2色譜方法進樣并測定，記錄色譜峰面積，計算加標回收率及測定結果的相對標準偏差，試驗結果見表7。由表7可知，水楊酸加標平均回收率為99.9%~102.3%，對氨基酚的加標平均回收率為97.7%~100.8%，對氯苯乙酰胺的加標平均回收率為98.1%~100.7%，測定結果的相對標準偏差均小于3.0%，表明該方法具有較高的準確度和良好的精密度，能夠滿足實際檢測的需要。

表7   樣品加標回收試驗結果

Tab. 7   Sample addition recovery test results

 

3、 結語

 

以紫外光譜掃描的最大吸收波長為參照，采用多波長高效液相色譜法同時檢測阿咖酚散/膠囊中可能存在危害人體健康的3種主要雜質。該方法靈敏度高、穩定性好，對阿咖酚散/膠囊雜質控制方面的不足加以補充，可為阿咖酚散/膠囊質量控制標準提升提供技術參考。

 

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引用本文： 曹夢欣，臧晴晴 . 多波長高效液相色譜法同時測定阿咖酚散/膠囊中3種雜質成分［J］. 化學分析計量，2024，33（8）：79. (CAO Mengxin, ZANG Qingqing. Simultaneous determination of three impurity components in Akafen powder/capsule by multi-wavelength high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(8): 79.)