實驗原理：

Dot blot是一種半定量的蛋白質(zhì)或核酸檢測方法，其原理是將待測物直接滴于固相載體上，然后通過特異性抗體或探針與待測物結(jié)合，最終通過可視化方法來檢測目標(biāo)分子的存在與否。

溶液配置：

操作步驟：

（1）減取適當(dāng)大小的PVDF膜，于甲醇活化1分鐘。

（2）將活化后的PVDF膜于ddH2O中，在脫色搖床上清洗15分鐘。

（3）提前預(yù)冷離心機，將樣品在4℃低溫條件下8000 rpm離心15分鐘，取上清作為樣品（分泌型蛋白）。

（4）取出活化后的PVDF膜在室溫晾至半干，看見水膜消失即可。將收集的上清、空白對照、陽性對照分別取5 μl點樣至PVDF膜上，風(fēng)干。室溫待樣品吸收，樣品吸收后點樣處顏色加深。

（5）封閉：待PVDF膜上樣品完全干燥后，于含5%脫脂奶粉的TBST溶液中封閉，37℃培養(yǎng)箱孵育2h或者4℃過夜孵育。

（6）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分鐘。

（7）一抗孵育：用含5%脫脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀釋比稀釋一抗，37℃培養(yǎng)箱孵育2h或4℃過夜孵育。

（8）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分鐘。

（9）二抗孵育：用含5%脫脂奶粉的TBST溶液以1：10000的稀釋比稀釋二抗，37℃培養(yǎng)箱孵育1.5 h。

（10）TBST清洗PVDF膜5次，每次5分鐘。

（11）曝光：用濾紙吸干PVDF膜上的TBST溶液，滴加ECL超敏顯色劑（A液：B液=1：1），提前將化學(xué)曝光儀預(yù)冷，進行曝光，觀察并記錄結(jié)果。

圖1. Dot Bolt鑒定分泌型蛋白表達

注意事項：

（1）在整個操作過程中，手不能直接接觸PVDF膜，以免蛋白污染或造成蛋白降解。

（2）脫脂奶粉封閉一定要充分，否則容易造成膜與蛋白的非特異性結(jié)合，膜上會出現(xiàn)雜點或假陽性，干擾試驗結(jié)果。

（3）一抗?jié)舛扰c二抗?jié)舛炔灰诉^高，否則容易造成高背景或者雜點。適宜濃度的選擇，可以通過不同濃度組合的預(yù)試驗進行確定。

（4）曝光時，時間的確定應(yīng)該具體情況具體分析，需要一定的實踐經(jīng)驗積累。

（5）ECL超敏發(fā)光液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

參考資料：

https://technologyinscience.blogspot.com/2019/06/dot-blot-technique-principle-procedure.html