摘 要： 建立高效液相色譜法測定坦西莫司的含量及有關(guān)物質(zhì)。使用ZORBAX SB-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈-0.2％（體積分?jǐn)?shù)）磷酸為流動相進(jìn)行梯度洗脫，流量為1.0 mL/min，檢測波長為280 nm，柱溫為45 ℃，進(jìn)樣量為20 µL。結(jié)果表明，坦西莫司的質(zhì)量濃度在5.03～251.5 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，檢出限、定量限分別為0.012、0.040 μg/mL。樣品的平均回收率為100.40%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.64%（n=9）。坦西莫司破壞試驗產(chǎn)生的雜質(zhì)峰能達(dá)到良好的檢測與分離。該方法專屬性強(qiáng)、準(zhǔn)確度高、靈敏度好，可用于坦西莫司含量及有關(guān)物質(zhì)的測定。

 

關(guān)鍵詞： 坦西莫司； 有關(guān)物質(zhì)； 含量測定； 高效液相色譜法

 

 

坦西莫司是由美國惠氏制藥公司研制，于2007年5月經(jīng)美國FDA批準(zhǔn)上市的藥物，主要用于晚期腎細(xì)胞癌的治療[1?2]，也是能夠顯著延長腎癌患者生存期的藥物。最近的研究結(jié)果表明，坦西莫司對多種腫瘤細(xì)胞具有較好的抗腫瘤活性，包括子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、肺癌等[3]。坦西莫司是西羅莫司(雷帕霉素)C42位丙酸酯類衍生物，是西羅莫司靶蛋白(mTOR)的特異性抑制劑[4?5]。其作用機(jī)制是與胞漿蛋白FKBP-12結(jié)合并形成復(fù)合物，從而抑制mTOR激酶，阻斷多條細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞周期在G1到S階段停滯，抑制細(xì)胞生長和增殖，同時降低血管生長因子的水平，阻止腫瘤新生血管的發(fā)展，從而發(fā)揮抗腫瘤作用[6?7]。與西羅莫司相比，坦西莫司的親水性更強(qiáng)，在相同濃度下的抗腫瘤活性也更強(qiáng)[8?9]，而且藥物的不良反應(yīng)較小[10]。

坦西莫司中雜質(zhì)的含量直接關(guān)系到臨床治療的療效及安全性，為保證其質(zhì)量安全可靠，有必要制定更為合理的檢測方法來控制坦西莫司中的有關(guān)物質(zhì)。高效液相色譜法用于檢測西羅莫司有關(guān)物質(zhì)及含量的方法多有報道[11?13]，但高效液相色譜法檢測血漿中坦西莫司蛋白結(jié)合率偶有報道[14?15]。筆者建立了測定坦西莫司含量及有關(guān)物質(zhì)的高效液相色譜方法，該方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、簡便快捷，能夠?qū)μ刮髂局械碾s質(zhì)以及生產(chǎn)、貯存過程中降解產(chǎn)物等進(jìn)行有效控制。

 

 

1、 實驗部分

 

 

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：LC-20AT型，二極管陣列檢測器，日本島津公司。

數(shù)控超聲波清洗儀：KQ-50E型，江蘇昆山市超聲儀器有限公司。

紫外分光光度計：UV-2450 PC型，日本島津公司。

電子天平：NewClassic MS105DU型，感量為0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司。

光照穩(wěn)定性試驗箱：TE-500LA型，上海康勵儀器設(shè)備有限公司。

坦西莫司對照品：批號為J02H182905，含量99.80%，上海源葉生物科技有限公司。

坦西莫司樣品：批號為20221108、20230215、20230320，吉林省藥物研究院。

坦西莫司粗品：批號為20221101，吉林省藥物研究院。

乙腈：色譜純，賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

磷酸：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

實驗用水為超純水。

1.2 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，美國安捷倫科技有限公司)；流動相：A相為乙腈，B相為0.2%(體積分?jǐn)?shù)，下同)磷酸溶液，流量為1.0 mL/min；檢測波長：280 nm；柱溫：45 ℃；進(jìn)樣體積：20 μL；洗脫方式：梯度洗脫，洗脫程序見表1。

表1   梯度洗脫程序

Tab. 1   Condition of mobile phase in gradient elution

 

 

1.3 溶液制備

粗品溶液：精密稱取坦西莫司粗品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為樣品粗品溶液。

樣品溶液：精密稱取坦西莫司樣品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為有關(guān)物質(zhì)樣品溶液。

對照溶液：精密量取上述樣品溶液1 mL置于100 mL容量瓶中，加入乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為有關(guān)物質(zhì)對照溶液。

含量測定溶液：精密量取上述樣品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為含量測定溶液。

對照品溶液：精密稱取坦西莫司對照品12.5 mg，置于25 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為對照品儲備液。精密量取上述溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，加乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為對照品溶液。

空白溶劑：取乙腈溶液作為空白溶劑。

光照破壞溶液：稱取樣品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈溶解并稀釋至標(biāo)線，置于光照箱內(nèi)照射8 h，搖勻濾過，作為光照破壞溶液。

高溫破壞溶液：稱取樣品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解后滴加適量水，于80 ℃水浴加熱6 h，取出放冷，加入乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為高溫破壞溶液。

堿破壞溶液：稱取樣品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解后，加入0.1mol/L氫氧化鈉1 mL，室溫放置5 min，然后用0.1 mol/L鹽酸調(diào)pH為中性，加入乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為堿破壞溶液。

氧化破壞溶液：稱取樣品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解后，加入30%過氧化氫1 mL，室溫放置24 h，然后加入乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為氧化破壞溶液。

酸破壞溶液：稱取樣品5.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加入少量乙腈溶解后，加入1 mol/L鹽酸1 mL，常溫放置1 h，然后用1 mol/L氫氧化鈉調(diào)pH為中性，加入乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻濾過，作為酸破壞溶液。

1.4 實驗步驟

取對照品溶液及含量測定溶液，在1.2儀器工作條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖峰面積，按外標(biāo)法計算樣品的含量。取樣品溶液及樣品對照溶液，在1.2色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄3倍坦西莫司峰保留時間下的色譜圖，按主成分自身對照法計算雜質(zhì)含量。

 

 

2、 結(jié)果與討論

 

 

2.1 檢測波長的選擇

精密吸取坦西莫司對照品溶液適量，加入乙腈稀釋，配制成10 μg/mL的溶液，按照紫外-可見分光光度法在200～400 nm波長處掃描，結(jié)果表明在280 nm波長處有最大吸收。在破壞性試驗中，大多數(shù)降解產(chǎn)物均在280 nm波長處有較強(qiáng)的紫外吸收，主成分坦西莫司在280 nm波長處也有吸收，因此檢測波長均選定為280 nm。

2.2 流動相的選擇

有關(guān)物質(zhì)條件摸索時選擇不同配比的乙腈和水做流動相，發(fā)現(xiàn)主峰峰形不好、拖尾嚴(yán)重，與相鄰的雜質(zhì)峰分離度小于1.5。因該化合物為弱酸性，若在流動相中加入少量酸如磷酸溶液，可以消除峰拖尾現(xiàn)象，因此選用乙腈與不同濃度的磷酸作流動相。以乙腈與0.1%磷酸作為流動相時，主峰峰形較好，但是與相鄰的雜質(zhì)峰分離度小于1.5；以乙腈與0.2%磷酸作為流動相，初始體積比為65：35，進(jìn)行梯度洗脫，主峰保留時間約為16 min，與相鄰的雜質(zhì)峰分離度大于1.5，所有色譜峰能達(dá)到基本分離，最終選擇乙腈-0.2%磷酸作為流動相。

2.3 柱溫的選擇

考察柱溫35、40、45、50 ℃時，坦西莫司主成分色譜保留時間、理論塔板數(shù)以及主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度。結(jié)果表明，隨著柱溫升高，主峰出峰時間略有提前，主峰與相鄰雜質(zhì)峰的分離度有增加趨勢。45 ℃和50 ℃沒有顯著區(qū)別，考慮到較低的柱溫更適用于延長色譜柱的壽命，因此選擇柱溫為45 ℃。

2.4 專屬性試驗

精密量取空白溶劑及坦西莫司粗品溶液各20 µL，在1.2色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。色譜圖如圖1、圖2所示，從圖1、圖2可以看出，空白溶劑無干擾，坦西莫司粗品溶液中共有13個雜質(zhì)峰，多數(shù)雜質(zhì)峰能夠達(dá)到基線分離，坦西莫司色譜峰形良好，保留時間約為16 min，與相鄰色譜峰分離度大于1.5。理論塔板數(shù)以坦西莫司峰計大于6000。

圖1   空白溶劑色譜圖

Fig. 1   Chromatogram of blank solvent

圖2   坦西莫司粗品溶液色譜圖

Fig .2   Chromatographic diagram of crude temsirolimus solution

2.5 破壞性試驗

為考察坦西莫司可能的降解產(chǎn)物及色譜條件的選擇是否合理，采用酸、堿、氧化、高溫和光照對其進(jìn)行破壞處理。破壞性試驗色譜圖如圖3所示，從圖3中可以看出，空白對照溶液無干擾，坦西莫司在酸、堿、氧化、高溫和光照破壞條件下所產(chǎn)生的降解產(chǎn)物均與主峰達(dá)到很好的分離，用二極管陣列檢測器對各個降解圖譜的主峰進(jìn)行峰純度分析，其峰純度均為1.0，均為單一純色譜峰，表明該方法具有良好的專屬性。

 

 

圖3   破壞性試驗色譜圖

Fig .3   HPLC Chromatograms of degradation tests

a—未破壞；b—光照破壞；c—高溫破壞；d—堿破壞；e—氧化破壞；f—酸破壞

 

2.6 線性關(guān)系、檢測限及定量限

分別精密量取對照品儲備液0.1、0.5、1、2、3、5 mL，置于10 mL容量瓶中，加入乙腈稀釋至標(biāo)線，搖勻，濾過，在1.2色譜條件下，精密量取20µL注入液相色譜儀中，記錄色譜圖。以溶液質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，坦西莫司在質(zhì)量濃度5.03～251.5 μg/mL的范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，線性方程為y=24.468x-0.177 4，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

精密量取坦西莫司對照品溶液，用乙腈逐級稀釋后進(jìn)樣，以信噪比為3對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為檢出限，以信噪比為10對應(yīng)質(zhì)量濃度作為方法定量限，得到檢出限、定量限分別為0.012、0.040 μg/mL。

2.7 精密度試驗

取批號為20221108的樣品，按1.3含量測定溶液方法平行制備6份樣品，在1.2色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄色譜圖。計算樣品中坦西莫司的含量，考察本方法的精密度，精密度試驗結(jié)果見表2。由表2可知，坦西莫司平均含量為99.25%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.10%(n=6)，表明該方法精密度良好。

表2   精密度試驗結(jié)果

Tab. 2   Test results of precision

 

 

2.8 樣品加標(biāo)回收試驗

分別精密稱取坦西莫司原料5、6.25、7.5 mg，每種濃度3份共9份，分別置于25 mL容量瓶中，然后再稱取坦西莫司對照品約5、6.25、7.5 mg，每種濃度3份共9份，分別添加相應(yīng)的容量瓶中，按1.3方法制備含量溶液，制成低、中、高3種濃度(相當(dāng)于對照品溶液的80%、100%和120%)的溶液，在按1.2色譜條件下測定，計算加標(biāo)回收率，樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果見表3。由表3可知，坦西莫司的平均回收率為100.40%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.64%(n=9)，表明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表3   樣品加標(biāo)回收試驗結(jié)果

Tab. 3   Results of recovery test of spiked samples

 

2.9 穩(wěn)定性試驗

精密稱取批號為20221108樣品，按1.3方法制備含量測定溶液，按1.2色譜條件，分別在0、2、4、6、8、24 h進(jìn)樣，記錄色譜圖，穩(wěn)定性試驗結(jié)果見表4。由表4可知，坦西莫司峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.72%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性較好。

表4   穩(wěn)定性試驗結(jié)果

Tab. 4   Test results of stability

2.10 樣品測定

取自制3批樣品，按1.3項下方法制備，按照1.2項的色譜條件測定，結(jié)果見表5。有關(guān)物質(zhì)測定中最大單個雜質(zhì)不得過0.1%，雜質(zhì)總和不得過1.0%，含量測定結(jié)果應(yīng)大于為99.0%，上述樣品測定結(jié)果均在標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的范圍內(nèi)。

表5   坦西莫司樣品有關(guān)物質(zhì)測定結(jié)果

Tab. 5   Test resuLts of the related substances in temsirolimus samples

 

3、 結(jié)語

 

建立了HPLC法測定坦西莫司的含量及有關(guān)物質(zhì)，通過方法學(xué)驗證，表明該方法靈敏度高、專屬性強(qiáng)、簡便快捷，可有效地分離檢測樣品中的雜質(zhì)及降解產(chǎn)物，可用于坦西莫司的質(zhì)量控制，為坦西莫司質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供重要依據(jù)。該方法為科學(xué)評價坦西莫司制劑配方工藝提供可靠的實施途徑，具有重要的研究和實際應(yīng)用價值。

 

 

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