多肽類藥物分子大小介于小分子化藥和大分子蛋白質之間，因而具有小分子化藥及大分子蛋白質無法比擬的優點，比如比小分子化藥擁有更高的活性和選擇性，比大分子蛋白質擁有更低的免疫原性及生產可及性。憑借這些獨特的藥理作用優勢，加之日趨成熟的多肽合成技術，多肽類藥物已成為藥物研發的熱點，具有廣闊的開發前景。

與化藥小分子一樣，多肽類藥物中的雜質（有關物質）也是影響藥物安全性的重要因素，如何對這些雜質進行表征和控制是多肽類藥物開發的重要工作之一。在眾多雜質表征工具中，LC-MS是公認的分子量解析的最有效手段，在多肽類藥物的雜質研究中有著明顯的優勢。

然而，基于多肽類藥物的特殊性質，為獲得理想的分離效果，在多肽有關物質檢測中使用的添加劑大多與MS不兼容，其中使用最多的添加劑是三氟乙酸，因為它是一種強疏水性酸同時也是一種非常有效的離子配對劑，可以最大限度地減少色譜的二次相互作用，獲得出色的峰型及分離，而三氟乙酸有明顯的離子抑制作用，與質譜不兼容，這就為多肽的雜質研究增加了難度，那么多肽類藥物的雜質研究藥怎樣進行呢，有哪些解決困難的手段呢？

1、 直接替換法

最直接的最簡單的方法是以質譜兼容的酸或鹽替代三氟乙酸，可替換的酸（鹽）包括甲酸（甲酸銨）、乙酸（乙酸銨）、二氟乙酸、三氟丙酸等。

1）甲酸、乙酸及其可揮發性緩沖鹽

最常見的是以甲酸替代三氟乙酸。

例如在某重組GLP-1類似物的雜質譜研究中，因三氟乙酸對儀器有損傷故而選擇甲酸替代三氟乙酸，結果獲得了較好的質譜響應（見圖1），結合MALDI高分辨質譜以及氨基酸全序列測序的結果，對雜質進行了解析，確證了可能的氨基酸序列（圖2）。

圖1 主要雜質質譜圖（圖片來源于文獻1）

圖2 主要雜質氨基酸序列（圖片來源于文獻1）

除了酸也可以采用相應的可揮發性鹽。

例如：在抗菌肽（cbf-14）的降解機理研究中，以甲酸銨緩沖液（pH3.0）為流動相，測定了降解雜質的分子量信息，根據分子量初步推測出其結構（見圖3），并闡明了這些雜質的來源和形成機制，為后續Cbf-14和其他多肽產品質量研究提供參考。

圖3 Cbf-14雜質結構式推測（圖片來源于文獻2）

2）二氟乙酸

以甲酸、乙酸及其相應的可揮發性鹽替換三氟乙酸是最常見的行之有效的作法，但是在實際應用過程中會發現很多多肽在甲酸或甲酸銨等流動相中峰型較差，分離度嚴重受損，并且那些對pH較為敏感的組分保留時間及出峰順序可能會發生難以預測的變化，影響雜質指認。這時可以考慮以二氟乙酸替換三氟乙酸（見圖4）。

二氟乙酸的酸強度較甲酸強，可以最大限度的確保出峰順序不發生變化，同時又可以獲得較好的色譜峰型和分離度，此外由于其疏水性較低，有利于影響電噴霧液滴的表面張力對質譜信號沒有明顯的抑制作用，可以在盡量確保峰容量的情況下獲得較強的質譜響應。有學者采用8種不同的多肽組分，分別以0.1%甲酸、0.1%二氟乙酸及0.1%三氟乙酸為流動相，對比其質譜響應，證實了二氟乙酸的質譜響應較三氟乙酸有明顯提升（見圖5）。

圖5 甲酸、二氟乙酸、三氟乙酸質譜響應對比圖（圖片來源于文獻4）

遺憾的是，目前這種試劑普遍還沒有色譜級或質譜級規格產品，購買的產品中通常有較高濃度的鈉和鉀，可能會破壞質譜的可解釋性，使用時需仔細評估其純度，必要時可蒸餾處理后使用。

2、 二維色譜

除了上述直接替換的方法，還可以嘗試二維色譜法。二維色譜既可以原汁原味的保留多肽類藥物的有關物質液相條件，同時又避免了質譜兼容性差的問題。

二維色譜最初是用于解決多組分樣品在一維色譜難分離的問題的，近些年也逐漸被用于解決質譜難兼容的雜質研究問題，多肽類藥物的雜質研究就是其中之一。通常第一維色譜采用有關物質色譜條件，然后選擇待研究雜質組分將其切入二維色譜中，二維色譜是與質譜兼容的色譜條件，二維色譜通常采用簡單的通用大梯度或者等度，通過二維色譜將待測組分送入質譜檢測器，測定其分子量。

例如某多肽類原研制劑CBTC，依據其進口注冊標準，有關物質方法的流動相為磷酸鹽緩沖液，由于磷酸鹽是難揮發性鹽，因此與質譜難兼容，在其雜質研究中研發人員運用二維液相色譜技術進實現一級分離組分的快速脫鹽處理，然后進行質譜分析，最終對標準中提到的雜質進行了定性分析，并推測出其結構，結果見下表（見表1）。

表1 CBTC 雜質列表

3、 半制備

如果既無法找到適宜的替代添加劑也不具備二維色譜，還可以嘗試一種稍復雜的方法，就是從液相中接出待測組分，然后將其富集，再通過LC-MS測定其分子量。這種方式適合測定含量相對較高且與相鄰雜質基線分離的雜質。在某項目中，我們需要測定某多肽酸降解雜質的分子量，有關物質方法中使用的添加劑是三氟乙酸，當時采用甲酸替換三氟乙酸導致分辨率極度下降且雜質出峰順序似乎發生了變化，無法辨別哪個雜質是酸降解雜質，當時也沒有二維色譜，于是先采用分析液相高濃度進樣，然后接收酸降解雜質的餾分，大體積注入質譜儀中，最終獲得了該雜質的分子量。

小結

多肽類藥物的雜質研究是其質量控制的重要組成，當所開發的有關物質檢測方法與質譜難兼容時我們不妨試試上述幾種方法，不管是哪一種多肽，相信總有一種辦法適合你。

參考文獻

[1] 梁濤，GLP-1類似物雜質研究（研究論文）

[2] Yitong Huo，Characterization of structurally related peptide impurities using HPLC?QTOF?MS/MS: application to Cbf?14, a novel antimicrobial peptide，Analytical and Bioanalytical Chemistry (2022) 414:6485–6495.

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[5]王書珊，?維液相?譜-質譜聯?技術在多肽類藥物有關物質研究中的應?（研究論文）