內容提要：二類含殼聚糖敷料作為創面敷料中的一類產品，包括含殼聚糖、改性殼聚糖不同結構形態和臨床預期用途的產品。作為與創面直接接觸的醫療器械產品，在注冊申報過程中進行生物學評價是必不可少的環節。通過對二類含殼聚糖敷料產品的實例分析，探討在注冊技術審評中運用標準GB/T 16886.1-2022《醫療器械生物學評價 第1 部分：風險管理過程中的評價與試驗》進行評價的問題，為相關產品研發、注冊及審評提供參考。

關 鍵 詞：二類含殼聚糖敷料 生物學評價 技術審評

創面敷料是臨床廣泛應用的醫療器械產品，主要用于各類創面的護理，在醫療器械分類目錄中其分類編碼為14（注輸、護理和防護器械）-10（創面敷料），在三級目錄類下面又細分為創面敷貼、粉末敷料、凝膠敷料、液體/ 膏狀敷料、纖維敷料、泡沫敷料以及含殼聚糖敷料等12 個大類。這些大類主要是根據產品外觀形態或形式進行劃分，僅有碳纖維和活性炭敷料、含殼聚糖敷料這兩類是依據材質劃分出來的。其中，含殼聚糖敷料由于材料本身所具有的一些特性，以其為原材料制成的含殼聚糖敷料產品也備受關注，敷料所含的殼聚糖包括殼聚糖和殼聚糖衍生物，結構上也有敷貼、粉末/ 顆粒、纖維、無紡布、海綿等多種不同形式。作為與人體創面直接接觸的醫療器械產品，在產品研制和注冊申報過程中進行生物學評價是必不可少的環節。GB/T 16886系列標準是醫療器械生物學評價的主要依據，但在具體應用過程中除應考慮的生物學風險評定終點外，還涉及諸多具體的試驗項目、試驗方法的選擇及對試驗結果的分析評定等復雜問題。研究和總結分析不同二類含殼聚糖敷料的生物學評價，對于此類產品的研制、注冊和技術審評具有重要意義。

1.生物學評價途徑及終點

二類含殼聚糖敷料產品的生物學風險評價途徑與其他醫療器械一樣，可以采用生物學試驗的方式，也可以通過醫療器械/ 材料與市售產品的等同性比較的方式進行評價。按照GB/T 16886.1-2022《醫療器械生物學評價 第1 部分：風險管理過程中的評價與試驗》[1]，醫療器械生物學評價的系統方法框圖中，在明確產品與患者接觸并獲得物理/ 化學信息后，需要從材料（配方）、加工過程和滅菌（類型/過程細節）、幾何和物理特性、人體接觸方式和臨床使用方式四方面論證與市售器械的等同性。以材料等同性的論證為例，這個等同性不僅僅是指比較兩個材料本身在化學名稱或組成等方面是否是完全等同或一致，而是需要從毒理學方面的等同性進行具體的比較，通過論證材料本身及其生產過程中可能引入的物質（如反應物、催化劑、溶劑、加工助劑、染色劑等），以及這個過程中產生的各種副產物，在毒理學或者生物安全性方面能否不低于臨床已使用的同類材料，這些論證均需要提供相應的支持性數據資料。對于大多數注冊申請人來講，如通過與其他企業上市產品進行等同性比較的方式評價，在實際操作過程中需要做的研究工作量巨大，且申請人自身或其委托進行評價的機構要具備相當高的分析測試能力及技術水平，而且整個評價過程和最終結果也具有一定的不確定性。因此，目前注冊申請人采用等同性比較方式進行評價多局限于與自家生產的上市產品進行比較，通過生物學試驗進行評價仍是現階段主要依賴的評價途徑。

采用生物學試驗方式進行評價，首先需要確認產品與人體接觸的性質與時間。根據《醫療器械分類目錄》，二類含殼聚糖敷料的臨床預期用途被限定為“非慢性創面”的應用，且要求“所含成分不可被人體吸收”。因此，該產品與人體接觸時間均<30d，包括短期接觸（≤24h）和長期接觸（>24h，≤30d）兩種情形，與人體接觸性質屬于表面接觸醫療器械中的破裂或損傷表面，依據GB/T 16886.1-2022，在已知產品物理和/ 或化學信息前提下，生物學風險評定終點短期接觸產品應包含細胞毒性、致敏反應、皮內反應、材料介導的致熱性、急性全身毒性反應，與人體長期接觸的產品在此基礎上還應增加亞急性毒性和植入反應。相較原標準GB/T 16886.1-2011，可以看到對短期接觸產品生物學評價項目增加了致熱性、急性全身毒性反應，長期接觸產品增加了致熱性、急性全身毒性、亞急性毒性和植入反應。

2.生物學評價實例及分析

二類含殼聚糖敷料在外觀形態上涵蓋了敷貼、粉末/ 顆粒、纖維、無紡布、泡沫等不同形式，所含殼聚糖包括殼聚糖本身以及殼聚糖衍生物，其中敷料產品中所含殼聚糖衍生物以羧甲基殼聚糖占比較高。本文通過對不同類型含殼聚糖敷料的生物學試驗項目實例進行分析，從試驗樣品制備、各試驗項目具體方法的選擇以及對試驗結果的評價進行分析總結。在進行生物學試驗時應依據GB/T 16886.12-2017《醫療器械生物學評價 第12 部分：樣品制備與參照材料》[2] 進行樣品制備，而試驗樣品應適用于特定的試驗系統，不同產品和不同試驗項目及產品本身具體情況考慮采用適當的制備方法。在具體試驗方法的選擇上，不同試驗項目下一般會包含多個試驗方法，應結合產品本身特性、實際的臨床應用及試驗方法的可操作性等方面綜合考慮，選取適宜的方法。生物學試驗結果的評價也是一個重要的過程，有時從生物學試驗單一的結果方面并無法完成對產品安全性和有效性評價，還需結合材料或產品本身特性以及該類產品的臨床應用史等方面進行綜合評價。

2.1 體外細胞毒性試驗

體外細胞毒性試驗可以用來評估醫療器械產品對細胞的毒性，反映醫療器械產品的生物相容性問題，該試驗方法和結果判定的依據為標準GB/T 16886.5-2017《醫療器械生物學評價 第5 部分：體外細胞毒性試驗》[3]。該試驗主要通過將醫療器械與體外培養的細胞接觸，觀察和測量細胞的生存率、形態變化、代謝活性等指標來評估其對細胞的影響。體外細胞毒性試驗分為三類，分別是浸提液試驗、直接接觸試驗和間接接觸試驗。依據試驗的選擇應盡量模擬臨床使用情況或嚴于臨床條件的原則，含殼聚糖敷料通常采用浸提液試驗或直接接觸試驗這兩種方式對細胞毒性進行定量評價。而間接接觸試驗與臨床實際使用接觸方式不同，且僅用于細胞毒性的定性評價，通常用于材料的篩選，對于采用與已上市產品相同材質的產品，評價時一般不采用此試驗方法。

以敷貼形式的含殼聚糖敷料為例，其通常包含涂膠基材、含殼聚糖的敷芯和可剝離的保護層組成。這三個組成部分與人體接觸的性質各不相同：可剝離的保護層不與人體接觸，涂膠基材使用時僅與創面周圍的完整皮膚接觸，只有敷芯是與創面直接接觸的。因此對這三個組成部分應分別進行評價，其中可剝離的保護層不與人體接觸可免于生物學評價，涂膠基材和敷芯在通過試驗進行評價時可采用浸提液試驗、直接接觸試驗。

浸提液試驗-MTT法是在醫療器械體外細胞毒性試驗中最常采用的方法。在殼聚糖敷貼產品生物學試驗實例中，樣品制備使用細胞培養液（含10%胎牛血清的最小必需培養基）進行浸提，由于含血清培養液能支持細胞生長且具有極性和非極性介質特性，所以可采取單一介質浸提：取殼聚糖敷貼的敷芯，基于3cm2/mL的比例（額外吸收試驗樣品細胞培養液吸收量）；取殼聚糖敷貼的粘貼邊，基于6cm2/mL的比例，在細胞培養液中于（37±1）?C的溫度下，以60r/min的振蕩頻率浸提（24±2）h 制備的浸提液作為試驗液。由于陽性對照采用10%二甲基亞砜溶液，陰性對照為聚乙烯（基于6cm2/mL比例的浸提液），介質對照為不含試驗樣品的細胞培養液。試驗系統中細胞株采用小鼠成纖維細胞L929，用細胞培養基制備細胞懸浮液，調整細胞濃度為1×105個/mL，加入96 孔細胞培養板中，置于細胞培養箱（5%CO2，37?C）中孵育24h，形成近匯合單層細胞，吸出原培養基后分別在培養板中加入試驗液（產品浸提液）、陰性對照液（聚乙烯浸提液）、陽性對照液（10%二甲基亞砜溶液）以及介質對照液（細胞培養液）。將該培養板放入細胞培養箱中培養2h，然后在顯微鏡下觀察細胞形態。之后移去培養基加入MTT溶液，繼續在培養箱中培養2h，然后將孔內液體棄去加入異丙醇振蕩，用酶標儀測定吸光度（波長570nm），然后通過公式計算存活率：存活率（%）=100× 各供試組（試驗組、陰性對照組、陽性對照組）吸光度/ 介質對照組吸光度。試驗結果包括顯微鏡下各供試組細胞形態的觀察及存活率的定量檢測兩部分。最終結果顯示試驗組絕大部分細胞形態正常，細胞存活率為88%；陰性對照組絕大部分細胞形態正常，細胞存活率為95%；陽性對照組細胞層幾乎完全破壞，細胞存活率為2%。從試驗結果可看出，試驗組細胞存活率≥70%，無潛在細胞毒性。

對于所含殼聚糖為羧甲基殼聚糖的敷料產品，其體外細胞毒性與浸提液濃度密切相關，并受羧甲基殼聚糖的取代位置及羧基化程度影響[4]。羧甲基殼聚糖具有水溶性，也可溶解于含血清培養基中，在YY 0953-2015《醫用羧甲基殼聚糖》[5] 標準中，其生物學性能中明確用生理鹽水配制成含羧甲基殼聚糖2mg/mL的溶液，取此溶液進行細胞毒性試驗，但在更新后的YY/T 0953-2020《醫用羧甲基殼聚糖》[6] 標準中刪除了生物學評價的具體要求及試驗方法。依據GB/T 16886.12-2017，采用0.2g/mL的比例進行浸提，其試驗結果可能會表現出較高的細胞毒性。這與羧甲基殼聚糖本身的溶解性相關，其浸提液實際上為羧甲基殼聚糖溶液，較高的濃度會導致細胞處于高滲狀態，抑制細胞其生長。因此，如在較高浸提濃度下試驗結果表現出具有潛在細胞毒性時，需要注冊申請人對結果進行分析。可選取已上市同類產品進行平行試驗比對的方法，通過相同試驗條件下及浸提液逐級稀釋后細胞存活率的對比進一步說明產品生物相容性是否可接受。

2.2 刺激與皮膚致敏試驗

刺激與皮膚致敏試驗方法和結果判定的依據為GB/T 16886.10-2017《醫療器械生物學評價 第10 部分：刺激與皮膚致敏試驗》[7]。刺激試驗分為體外刺激試驗和體內刺激試驗，但目前體外皮膚刺激試驗僅用于純化學物，不適用于醫療器械浸提液。因此，醫療器械的刺激試驗還是采用體內刺激試驗，目前基本上都是通過動物皮膚/ 黏膜刺激試驗和動物皮內反應試驗進行評價。

敷貼形式的含殼聚糖敷料，由于其敷芯和可粘貼背襯與人體接觸性質不同，在刺激試驗時可采用不同的試驗方法。敷芯作為與創面直接接觸的部分，通常采用皮內反應試驗以評價產品產生刺激反應的潛能。而可粘貼的背襯只與創面周圍的完整皮膚接觸，可以選用皮膚刺激試驗進行評價。

敷芯進行皮內反應試驗時，試驗動物采用3 只體重不低于2kg 的家兔（新西蘭白兔）。制備浸提液時分別使用0.9%氯化鈉注射液（Sodium Chloride，SC）作為極性浸提介質、棉籽油（Cottonseed Oil，SCO）作為非極性浸提介質，浸提比例和方法與體外細胞毒性試驗一致，但浸提時間增加為（72±2）h。這是由于細胞毒性試驗中采用的浸提介質含有血清，長時間浸提會影響其穩定性，性質相對穩定的浸提介質SC和SCO 通常按照GB/T 16886.12-2017中推薦的加嚴浸提條件（37±1）?C、（72±2）h 進行。試驗空白對照采用不含試驗樣品的浸提介質以相同的方法制備。皮內反應試驗前4~18h對家兔進行稱重，并將其背部脊柱兩側的被毛徹底除去作為試驗和觀察部位，按照GB/T 16886.10-2017 注射點排列要求，分別皮內注射0.2mL的SC試驗液、SCO 試驗液、SC 對照液、SCO 對照液。在注射完成后立即觀察注射點即時反應，然后觀察并記錄注射后（24±2）h、（48±2）h、（72±2）h 3 個時間點注射部位的紅斑和水腫反應，并按照GB/T 16886.10-2017 中的標準記分。在（72±2）h 評分后，分別將每只動物試驗樣品或空白對照3個時間點的全部紅斑和水腫的記分相加，再除以15，通過計算得出每只家兔試驗樣品或空白對照的記分。然后將3 只家兔記分相加除以3，得出每一試驗樣品或空白對照的總平均記分。試驗樣品的記分減去空白對照的記分可得出試驗樣品最終記分，如試驗樣品最終記分≤1.0，則符合試驗要求。殼聚糖敷貼的敷芯試驗結果為SC和SCO試驗液的家兔皮內反應最終記分均≤1.0，說明敷芯皮內反應的試驗結果是符合標準要求的。

對于可粘貼的背襯部分，采用皮膚刺激試驗來評價產生刺激反應的潛能。試驗動物也是采用3 只體重不低于2kg 的家兔（新西蘭白兔），將試驗樣品（殼聚糖敷貼的粘貼邊）單次直接接觸家兔背部脊柱兩側的皮膚24h，將紗布塊同法接觸作為對照。于接觸后（24±2）h、（48±2）h、（72±2）h，對接觸部位紅斑、水腫記分，計算原發性刺激指數。試驗結果為殼聚糖敷貼的粘貼邊家兔原發性刺激指數為0.0，說明可粘貼背襯的皮膚刺激是符合要求的。

皮膚致敏試驗是用于測定產品潛在皮膚致敏性的動物試驗。目前該試驗有三種方法：小鼠局部淋巴結試驗、豚鼠最大劑量試驗、封閉式貼敷試驗。這三種方法中最大劑量試驗是最敏感的方法，含殼聚糖敷料產品通常采用此試驗方法進行評價。殼聚糖敷貼試驗液分別采用SC、SCO 浸提，比例與體外細胞毒性試驗一致，（37±1）?C條件下振蕩浸提（72±2）h。陽性對照為1- 氯-2,4- 二硝基苯，介質對照采用不含試驗樣品的浸提介質（SC、SCO）以和試驗液相同的方法制備，共取30 只豚鼠作為試驗動物進行試驗。試驗分為皮內誘導階段、局部誘導階段和激發階段。將SC和SCO兩種試驗液分別注射于試驗組豚鼠背部剃毛區，并用浸透了試驗液的濾紙片進行封閉固定，用以誘導皮膚致敏反應。試驗激發階段在局部誘導完成后14d 進行，把試驗液浸透的濾紙片封閉固定于試驗組動物誘導階段其他未試驗的部位- 腹部剃毛區，封閉貼敷（24±2）h 后除去，觀察并記錄在去除濾紙片后24h和48h所有動物激發部位皮膚情況，按Magnusson和Klingman分級標準進行描述并分級，對照組動物同法操作。試驗結果為殼聚糖敷貼SC和SCO試驗液均未導致豚鼠出現皮膚致敏反應。

2.3 熱原試驗與急性全身毒性

目前，針對熱原檢測的試驗主要有兩種，分別是熱原檢查法（家兔法）和細菌內毒素法（鱟試劑法），細菌內毒素是產生致熱反應的因素，但材料和其他物質也可能會導致致熱性，細菌內毒素法無法全面反映醫療器械的致熱性，因此熱原檢查法（家兔法）被作為仲裁法。

在殼聚糖敷貼熱原試驗依據的是標準GB/T 16886.11-2021《醫療器械生物學評價 第11 部分：全身毒性試驗》[8]，試驗方法則按照《中華人民共和國藥典》2020 年版四部通則1142 熱原檢查法進行，確定樣品試驗液經靜脈注射家兔后是否會導致熱原反應。由于殼聚糖敷貼只有敷芯與創面接觸，所以僅需對敷芯進行熱原試驗。浸提介質為SC，基于3cm2/mL的比例，（37±1）?C條件下振蕩浸提（72±2）h。試驗時首先要選取可供熱原檢查用的家兔3 只，需每30min 測量并記錄試驗動物的直腸溫度，共測量8 次。只有8 次體溫均為38?C~39.6?C，且最高與最低體溫相差不超過0.4?C的家兔才可使用。試驗時按照10mL/kg的劑量，經耳緣靜脈分別對3 只家兔進行樣品試驗液的注射，注射后3h 內每隔30min測量家兔直腸溫度并記錄。試驗結果3只家兔體溫升高均低于0.6?C，并且3 只家兔升溫總和低于1.3?C，3h 觀察時間內家兔體溫變化在《中華人民共和國藥典》可接受的范圍內，殼聚糖敷貼（敷芯）沒有致熱性。

急性全身毒性試驗是用于評價在短時間內（通常為24h內）一次或多次接觸試驗樣品后在72h 內發生不良反應的情況。對于殼聚糖敷貼產品，也是僅需評價敷芯部分，與完整皮膚接觸的粘貼背襯是無須進行該試驗的。試驗樣品制備也是采用浸提液，浸提介質分別使用SC和SCO，浸提比例和條件與熱原試驗一致，對照組采用不含試驗樣品的浸提介質（SC和SCO）以相同的方法制備。依據GB/T 16886.11-2021《醫療器械生物學評價 第11 部分：全身毒性試驗》，試驗動物使用昆明小鼠20 只，2 個試驗組和2 個對照組，每組5 只小鼠，試驗前先將小鼠標記并稱重。采用腹腔注射（IP）法，按照50mL/kg的劑量分別注入SC試驗液、SCO試驗液、SC對照液、SCO對照液，腹腔注射完成后立即觀察小鼠所有行為表現，然后觀察注射后4h、24h、48h、72h 小鼠的行為表現和觀測有無死亡動物，并記錄小鼠在24h、48h、72h 時的體重。試驗結果為試驗組與對照組小鼠均未見死亡和異常癥狀，所有動物體重均有增加，試驗液給予試驗小鼠后未見明顯急性全身毒性反應。

3.小結

生物學評價是確保二類含殼聚糖敷料產品安全性和有效性所必須進行的研究內容，目前主要依據GB/T 16886 系列標準以開展相關生物試驗的方式進行。但在具體實施過程中，對于試驗項目、試驗方法及試驗條件的選擇方面，由于醫療器械產品種類繁多，標準無法細化到每個產品，還是需要研究者根據產品情況具體分析和選擇。本文選取二類含殼聚糖敷料的生物學評價實例，列舉了體外細胞毒性試驗、刺激與皮膚致敏試驗、熱原試驗、急性全身毒性試驗采用的具體試驗方法和結果，并進行相應的分析，希望可以為二類含殼聚糖敷料產品的研制、注冊和技術審評提供一定參考。