摘 要： 建立高效液相色譜法測定化妝品中19種非甾體抗炎藥含量。化妝品樣品經(jīng)體積比為1∶1的乙腈-乙酸銨溶液超聲提取，用C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）分離，以不同體積比的乙腈-乙酸銨溶液為流動相梯度洗脫，采用二極管陣列檢測器檢測。布洛芬的檢測波長為230 nm，醋氯芬酸、雙氯芬酸鈉檢測波長為278 nm，其余16種非甾體的檢測波長均為245 nm。19種非甾體的質(zhì)量濃度在5～200 μg/mL范圍內(nèi)與其對應的色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.999 5，檢出限為0.2～8 mg/kg。空白樣品的水劑和凝膠基質(zhì)的加標平均回收率分別為93.1%～110.9%和91.3%～108.1%，測定結(jié)果的相對標準偏差分別為0.2%～3.5%和0.6%～4.2%（n=6）。該方法適用于化妝品中19種非甾體抗炎藥的測定。

 

關(guān)鍵詞： 高效液相色譜法； 非甾體抗炎藥； 化妝品

 

 

非甾體抗炎藥物(NSAIDs)是目前臨床應用最多、最廣的處方藥之一[1]。其藥理作用機制主要是通過抑制環(huán)氧化酶，減少炎性介質(zhì)前列腺素的合成，從而產(chǎn)生解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用。非甾體抗炎藥物種類繁多，在臨床應用過程中，出現(xiàn)了越來越多的不良反應，如肝損傷[2]、胃腸道[3]及皮膚損害[4]等。某不良反應監(jiān)測中心對2008～2019年5597例有效自發(fā)報告患者NSAIDs相關(guān)不良反應(ADRs)數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，5597例ADRs報告中，累及多個系統(tǒng)/器官，共計6915例次，其中皮膚及皮膚附件損害1594例次(占23.05%)，僅次于胃腸系統(tǒng)損害1799例次(占26.02%)[5]。另有統(tǒng)計評估顯示，口服NSAIDs治療比外用NSAIDs治療的患者，胃腸道反應更常見，而外用NSAIDs組的皮膚反應發(fā)生率是口服NSAIDs組的5倍[6]，且雙氯芬酸通過頸后、頸椎透皮貼劑進行脊柱給藥，藥物可從貼片通過椎間隙擴散，穿透硬腦膜進入腦脊液，到達大腦[7]。上述研究揭示了NSAIDs有經(jīng)皮膚吸收進而影響人體健康的風險。

近年來，在部分宣稱祛痘、止癢、修護類化妝品的監(jiān)督抽檢中篩查出某些含有NSAIDs的化妝品。根據(jù)《已使用化妝品原料目錄名稱(2021年版)》[8]和《化妝品禁用原料目錄》[9]規(guī)定：“對乙酰氨基酚在淋洗類產(chǎn)品中最高歷史使用量為0.05%，但未提供駐留類產(chǎn)品最高歷史使用量”“非那西丁、辛可芬、異丙安替比林和保泰松為禁用成分”，其他非甾體暫未作規(guī)定。化妝品中非甾體大致有以下來源：一是人為添加，非甾體抗炎藥具有較好的抗炎、止痛和退紅腫作用，特別是祛痘修護類化妝品中少量添加可緩解炎癥及減少產(chǎn)品成分的刺激，從而達到較好的效果；二是原料帶入污染。由于非甾體能引起諸多不良反應，為保證人民用妝安全和滿足監(jiān)管需求，有必要建立化妝品中非甾體的檢測方法。

目前，關(guān)于NSAIDs的檢測方法有液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[10?12]，且大多應用在藥品領(lǐng)域，化妝品中尚無相關(guān)標準和文獻報道。筆者建立了高效液相色譜法測定水劑和凝膠類化妝品中19種非甾體抗炎藥含量的檢測方法，為化妝品中非甾體抗炎藥的風險篩查和日常監(jiān)管提供技術(shù)支持，同時也為后續(xù)相關(guān)研究提供參考。

 

 

1、實驗部分

 

 

1.1 主要儀器與試劑

液相色譜儀：LC-20AT型，配二極管陣列檢測器，日本島津公司。

超聲波清洗機：S300H型，德國艾爾瑪公司。

電子天平：XS205DU型，d=0.01 mg/0.1 mg，瑞士梅特勒-托利多公司。

超純水機：Milli-Q IQ 7000型，美國密理博公司。

高速冷凍離心機：Eppendorf 5810R型，德國艾本德公司。

乙腈：色譜純，美國霍尼韋爾公司。

乙酸銨：色譜級，純度(質(zhì)量分數(shù))不小于99.0%，上海麥克林生化科技有限公司。

冰乙酸：色譜級，上海麥克林生化科技有限公司。

對乙酰氨基酚、阿司匹林、4-甲氨基安替比林、安替比林、氨基比林、非那西丁、普拉洛芬、舒林酸、醋氯芬酸、異丙安替比林、酮洛芬、萘普生、艾瑞昔布、雙氯芬酸鈉、吲哚美辛、布洛芬、保泰松、塞來昔布18種非甾體抗炎藥標準品：純度(質(zhì)量分數(shù))均大于98%，中國食品藥品檢定研究院。

辛可芬標準品：純度(質(zhì)量分數(shù))為100%，阿法埃莎(中國)化學有限公司。

實驗用水為超純水。

化妝品樣品：市售。

1.2 溶液配制

乙酸銨溶液：0.02 mol/L，稱取1.54 g乙酸銨，加入950 mL水溶解，用冰乙酸調(diào)pH值至4.2，再加水至1 000 mL。

乙腈-乙酸銨溶液：取乙腈和0.02 mol/L乙酸銨溶液，按體積比1∶1混勻即得。

19種非甾體抗炎藥混合標準儲備溶液：精密稱取19種非甾體抗炎藥標準品各約10.0 mg，置于同一只10 mL棕色容量瓶中，用乙腈-乙酸銨溶液溶解并稀釋至標線，搖勻，配制成19種非甾體抗炎藥的質(zhì)量濃度均為1 000 μg/mL的混合標準儲備溶液。

19種非甾體抗炎藥系列混合標準工作溶液：取19種非甾體抗炎藥混合標準儲備溶液適量，用乙腈-乙酸銨溶液稀釋，配制成19種非甾體抗炎藥的質(zhì)量濃度均分別為5、10、20、50、100、200 μg/mL的系列標準工作溶液。

1.3 儀器工作條件

色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 µm，日本OSAKA SODA公司)；流動相：A相為乙腈，B相為0.02 mol/L乙酸銨溶液；檢測器：二極管陣列檢測器；檢測波長：布洛芬的檢測波長為230 nm，醋氯芬酸、雙氯芬酸鈉的檢測波長為278 nm，其余16種非甾體物質(zhì)的檢測波長均為245 nm；流量：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣體積：5 µL；梯度洗脫程序見表1。

表1   梯度洗脫程序

Tab. 1   Gradient elution procedure

 

1.4 樣品處理

精密稱取樣品1.0 g于10 mL比色管中，加入適量乙腈-乙酸銨溶液，渦旋分散1 min，加入乙腈-乙酸銨溶液至近標線，超聲提取20 min，放置至室溫，用乙腈-乙酸銨溶液定容至標線，搖勻，取上清液用

0.45 μm有機濾膜過濾，即為樣品溶液。

 

 

2、 結(jié)果與討論

 

 

2.1 色譜柱選擇

分別考察兩種粒徑(3 µm和5 µm)的OSAKA SODA CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm)對19種非甾體物質(zhì)的分離效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用3 µm粒徑的C18柱時，色譜峰型較好，但一些非甾體物質(zhì)較難分離，且出峰時間延長。采用5 µm粒徑的C18柱時，布洛芬、保泰松和塞來昔布色譜峰形稍寬，但能將19種非甾體物質(zhì)較好分離，不影響各組分的定性定量。綜合考慮，選擇OSAKA SODA CAPCELL PAK C18柱(250 mm×4.6 mm，5 µm)作為分離柱。

2.2 流動相選擇

參考相關(guān)文獻[13?22]，分別選擇乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液和甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動相進行試驗。結(jié)果表明，以乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動相時，19種非甾體物質(zhì)均能出峰，且調(diào)整比例后能達到分離要求；以甲醇-0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動相時，組分出峰時間延后，且布洛芬、保泰松、塞來昔布等組分無色譜峰，因此選用乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液作為流動相進行洗脫。

2.3 提取溶劑及超聲時間選擇

分別考察甲醇、乙腈、乙腈-乙酸銨溶液(體積比為75∶25)和乙腈-乙酸銨溶液(體積比為1∶1) 4種不同提取溶劑及不同超聲時間(10、20、30 min)時的樣品處理效果。結(jié)果表明，以乙腈、乙腈-乙酸銨溶液(體積比為75∶25)為提取溶劑時，提取效果較差；以甲醇、乙腈-乙酸銨溶液(體積比為1∶1)為提取溶劑、超聲20 min時均能較好地提取樣品中的非甾體，考慮到流動相溶劑及溶劑峰的影響，選擇乙腈-乙酸銨溶液(體積比為1∶1)作為提取溶劑，超聲時間為20 min。

2.4 檢測波長選擇

對19種非甾體物質(zhì)在190～600 nm波長范圍內(nèi)進行紫外光譜掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大部分非甾體在245 nm附近均有較強的紫外吸收，而布洛芬在230 nm附近有較大紫外吸收，其響應值是245 nm處的16倍多，醋氯芬酸、雙氯芬酸鈉在278 nm附近有較大紫外吸收，其響應值是245 nm處的2倍左右。為了提高檢測靈敏度，選擇布洛芬的檢測波長為230 nm，醋氯芬酸、雙氯芬酸鈉檢測波長為278 nm，其余16種非甾體的檢測波長為245 nm。

2.5 專屬性試驗

分別取空白樣品溶液、19種非甾體混合標準溶液及加標樣品溶液，按1.3色譜條件進行測定，色譜圖如圖1所示。圖1結(jié)果表明，空白樣品溶液無干擾，加標樣品溶液中19種非甾體物質(zhì)的保留時間與混合標準溶液中19種非甾體物質(zhì)保留時間一致，19種非甾體物質(zhì)的分離效果和峰型均良好，表明該方法具有良好的專屬性。

圖1   空白樣品溶液、19種非甾體混合標準溶液、加標樣品溶液色譜圖

Fig. 1   Chromatograms of blank sample solution，19 non-steroidal mixed standard solution and spiked sample solution

 

1—對乙酰氨基酚；2—阿司匹林；3—4-甲氨基安替比林； ；4—安替比林；5—氨基比林；6—辛可芬；7—非那西丁； ；8—普拉洛芬；9—醋氯芬酸；10—舒林酸；11—異丙安替比林； ；12—酮洛芬；13—萘普生；14—艾瑞昔布；15—雙氯芬酸鈉； ；16—吲哚美辛；17—布洛芬；18—保泰松；19—塞來昔布

 

2.6 線性方程與方法檢出限

取19種非甾體抗炎藥系列標準工作溶液，按1.3儀器工作條件進行測定，以標準溶液各組分質(zhì)量濃度(x，µg/mL)為橫坐標，相應色譜峰面積(y)為縱坐標繪制標準工作曲線，得到各組分的線性方程與相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表2。取質(zhì)量濃度為5 μg/mL混合標準溶液進行逐級稀釋并檢測，分別以3倍信噪比(S/N)和10倍信噪比(S/N)對應的質(zhì)量濃度作為方法檢出限和定量限，根據(jù)樣品取樣質(zhì)量為1.0 g，稀釋10倍體積換算為樣品中的含量，以質(zhì)量分數(shù)表示。19種非甾體抗炎藥的質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表2。

表2   質(zhì)量濃度線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

Tab. 2   Linear range of mass concentration，linear equation，correlation coefficient，detection limit and quantification limit

 

2.7 加標回收率與精密度試驗

選取空白樣品的水劑和凝膠基質(zhì)，分別加入適量的19種非甾體抗炎藥混合標準溶液，按1.4方法制備3種不同質(zhì)量濃度水平的加標樣品溶液，每個加標水平平行測定6次，計算回收率和測定結(jié)果的相對標準偏差，結(jié)果見表3。由表3可知，在水劑和凝膠基質(zhì)中的平均回收率分別為93.1%～110.9%和91.3%～108.1%，測定結(jié)果的相對標準偏差分別為0.2%～3.5%和0.6%～4.2%。表明該方法在水劑和凝膠兩種基質(zhì)中均具有良好的準確度和精密度。

表3   加標回收率與精密度試驗結(jié)果(n=6)

Tab. 3   Results of spiked recoveries and precision test (n=6)

 

2.8 穩(wěn)定性試驗

在一定條件下，有些非甾體不穩(wěn)定，會發(fā)生降解或分解，從而影響定量結(jié)果的準確性。對19種非甾體進行日間(24 h)穩(wěn)定性考察。取質(zhì)量濃度為20 μg/mL的同一19種非甾體標準溶液，每隔一段時間進行測定，計算各組分在不同時間點的質(zhì)量濃度，并計算相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表4。由表4可知，在24 h內(nèi)19種非甾體標準溶液的質(zhì)量濃度無太大變化，測定結(jié)果的相對標準偏差為0.3%～2.4%，表明在室溫條件下標準溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

表4   穩(wěn)定性試驗結(jié)果

Tab. 4   Stability test results

 

3、 結(jié)語

 

建立了高效液相色譜測定化妝品中19種非甾體抗炎藥的檢測方法。該方法樣品預處理簡單、重現(xiàn)性好、靈敏度高，適用于水劑和凝膠類化妝品中19種非甾體物質(zhì)的定量檢測。該方法綜合擴充了化妝品中非甾體的檢測種類，可為日后化妝品中非甾體的非法添加及質(zhì)量監(jiān)管提供參考。

 

 

參考文獻：

1 王利敏.非甾體抗炎藥不良反應發(fā)生表現(xiàn)及預防［J］.中國傷殘醫(yī)學，2016，24（7）：181.

    WANG Limin. Occurrence and prevention of adverse reactions to non-steroidal anti-inflammatory drugs［J］. Chinese Journalof Trauma and DisabilityMedicine，2016，24（7）：181.

 

2 陳熠媛，陳碩崴，張謝，等.對乙酰氨基酚肝毒性研究進展［J］.中國藥房，2019，30（8）：852.

    CHEN Yiyuan，CHEN Shuowei，ZHANG Xie，et al. Research progress on hepatotoxicity of acetaminophen［J］. China Pharmacy，2019，30（8）：852.

 

3 陳金，姚健鳳.非甾體類抗炎藥致老年人胃腸道不良反應研究進展［J］.中華老年病研究電子雜志，2017，4（4）：22.

    CHEN Jin，YAO Jianfeng. Research progress of gastrointestinal adverse reactions caused by non-steroidal anti-inflammatory drugs in the elderly［J］. Chinese Journal of Geriatrics Research，2017，4（4）：22.

 

4 吳萍，經(jīng)緯俊，劉杰，等. 32例含非甾體抗炎藥成分的藥物致嚴重皮膚不良反應分析［J］.中國醫(yī)院用藥評價與分析，2019，19（8）：1 007.

    WU Ping，JING Weijun，LIU Jie，et al. Analysis of 32 cases of severe cutaneous adverse reactions caused by drugs containing non-steroidal anti-inflammatory drugs［J］. Evaluation and Analysis of Drug-Use inHospitalsof China，2019，19（8）：1 007.

 

5 王嘉熙. 5597例非甾體抗炎藥的不良反應報告分析［J］.藥物流行病學雜志，2021，30（7）：457.

    WANG Jiaxi. Analysis of adverse reaction reports of 5597 cases of non-steroidal anti-inflammatory drugs［J］. ChineseJournal of Pharmacoepidemiology，2021，30（7）：457.

 

6 WANG Yuhui，F(xiàn)AN Miaozhen，WANG Huideng，et al. Relative safety and efficacy of topical and oral NSAIDs in the treatment of osteoarthritis：A systematic review and meta-analysis［J］. Medicine 2022，101（36）：e30354.

 

7 LEHRER S，RHEINSTEIN P H. Transspinal delivery of drugs by transdermal patch back-of-neck for Alzheimer's disease：a new route of administration［J］. Discov Med，2019，27（146）：37.

 

8 國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥監(jiān)局關(guān)于發(fā)布《已使用化妝品原料目錄（2021年版）》的公告（2021年　第62號）［EB/OL］.（2021-04-30）［2024-03-12］.https：//www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/hzhpggtg/jmhzhptg/20210430162707173.html.

    National Medical Products Administration. Announcement of National Medical Products Administration on the release of the Catalogue of Used Cosmetic Raw Materials （2021 Edition）（No. 62 of 2021）［EB/OL］.（2021-04-30）［2024-03-12］.https：//www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/hzhpggtg/jmhzhptg/20210430162707173.html.

 

9 國家藥品監(jiān)督管理局.國家藥監(jiān)局關(guān)于更新化妝品禁用原料目錄的公告（2021年第74號）［EB/OL］.（2021-05-28）［2024-03-12］.https：//www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/hzhpggtg/jmhzhptg/20210528174051160.html.

    National Medical Products Administration. Announcement of National Medical Products Administration on Updating the List of Prohibited Ingredients for Cosmetics （No. 74 of 2021）［EB/OL］.（2021-05-28）［2024-03-12］. https：//www.nmpa.gov.cn/xxgk/ggtg/hzhpggtg/jmhzhptg/20210528174051160.html

 

10 王靜，劉燕，楊琪，等. HPLC法測定雙氯芬酸鈉有關(guān)物質(zhì)［J］.中國藥師，2020，23（6）：1 226.

    WANG Jing，LIU Yan，YANG Qi，et al. Determination of diclofenac sodium related substances by HPLC［J］. China Pharmacist，2020，23（6）：1 226.

 

11 王南南，劉發(fā)貴.頂空-氣相色譜法測定醋氯芬酸中的殘留溶劑［J］.分析測試技術(shù)與儀器，2021，27（3）：214.

    WANG Nannan，LIU Fagui. Determination of residual solvent in aclofenac by headspace-gas chromatography［J］. Analysis and Testing Technology and Instruments，2021，27（3）：214.

 

12 言慧潔，劉偉，夏青松，等. UPLC-MS/MS法同時檢測抗風濕中藥制劑中非法添加的12種非甾體抗炎藥［J］.中國藥房，2017，28（27）：3 871.

    YAN Huijie，LIU Wei，XIA Qingsong，et al. Simultaneous detection of 12 non-steroidal anti-inflammatory drugs illegally added in traditional Chinese medicine preparations for rheumatism by UPLC-MS/MS［J］. China Pharmacy，2017，28（27）：3 871.

 

13 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（2020年版）：二部［M］.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2020.

    National Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of the People's Republic of China （2020 edition）：Part Ⅱ［M］. Beijing：China Medical Science and Technology Press，2020.

 

14 高翔，王濤，賈首前，等. HPLC法測定小兒酚氨咖敏顆粒中對乙酰氨基酚含量［J］.世界最新醫(yī)學信息文摘，2019（78）：266.

    GAO Xiang，WANG Tao，JIA Shouqian，et al. Determination of acetaminophen in children's phenolamine camin granules by HPLC［J］. World Latest Medicine Information，2019（78）：266.

 

15 李玲，陳乃江，姜燕.保泰松片HPLC含量檢測方法的建立［J］.中國醫(yī)藥科學，2015，5（17）：61.

    LI Ling，CHEN Naijiang，JIANG Yan. Establishment of HPLC method for determination of butazone tablets［J］. China Medicine and Pharmacy，2015，5（17）：61.

 

16 聶安軍，周英，呂文俊，等.塞來昔布片中塞來昔布的含量測定方法研究［J］.臨床醫(yī)藥文獻電子雜志，2019，6（5）：164.

    NIE Anjun，ZHOU Ying，LYU Wenjun，et al. Study on determination method of celecoxib in celecoxib tablets［J］. Electronic Journal of Clinical Medical Literature，2019，6（5）：164.

 

17 逯小萌.高效液相色譜法測定氨糖美辛腸溶片中吲哚美辛含量［J］.中國藥業(yè)，2014，23（24）：74.

    LU Xiaomeng. Determination of indomethacin in aminometacin enteric-coated tablets by high performance liquid chromatography［J］. China Pharmaceuticals，2014，23（24）：74.

 

18 趙大偉，王佩華.高效液相色譜法測定普拉洛芬滴眼液中普拉洛芬含量［J］.中國科技信息，2008，20（23）：200.

    ZHAO Dawei，WANG Peihua. Determination of praprofen in Praprofen eye drops by high performance liquid chromatography［J］. China Science and Technology Information，2008，20（23）：200.

 

19 劉彬果，葉盛英.高效液相色譜法測定感冒靈顆粒中咖啡因、阿司匹林和非那西丁含量［J］.中國藥業(yè)，2020，29（21）：75.

    LIU Binguo，YE Shengying. Determination of caffeine，aspirin and phenacetin in Ganmaoling granules by high performance liquid chromatography［J］. China Pharmaceuticals，2020，29（21）：75.

 

20 程侯連，杜學勤，王增仙，等. HPLC法測定復方醋氯芬酸緩釋微丸含量及穩(wěn)定性考察［J］.沈陽藥科大學學報，2019，36（9）：818.

    CHENG Houlian，DU Xueqin，WANG Zengxian，et al. Determination of compound acelofenac sustained-release pellets by HPLC and its stability［J］. Journal of Shenyang Pharmaceutical University，2019，36（9）：818.

 

21 盧彥芳，李飛高，張志清. HPLC法測定艾瑞昔布片的含量［J］.中國藥房，2013，24（45）：4 301.

    LU Yanfang，LI Feigao，ZHANG Zhiqing. The content of eracib tablets was determined by HPLC［J］. China Pharmacy，2013，24（45）：4 301.

 

22 羅敏婷，何海彤，伍志航.高效液相色譜法測定植物精油中雙氯芬酸鈉的含量［J］.香料香精化妝品，2020，48（6）：26.

    LUO Minting，HE Haitong，WU Zhihang. Determination of diclofenac sodium in plant essential oil by high performance liquid chromatography［J］. Flavour Fragrance Cosmetics，2020，48（6）：26.

 

引用本文： 張江維，張弦，譚杰，等 . 高效液相色譜法測定化妝品中19種非甾體抗炎藥［J］. 化學分析計量，2024，33（5）：12. (ZHANG Jiangwei, ZHANG Xian, TAN Jie, et al. Determination of 19 non-steroidal anti-inflammatory drugs in cosmetics by high performance liquid chromatography[J]. Chemical Analysis and Meterage, 2024, 33(5): 12.)