摘 要： 建立氣相色譜-質譜法測定替格瑞洛中間體［4，6-二氯-2-（丙硫基）-5-氨基嘧啶（DCPA）］中潛在基因毒性雜質1-溴丙烷。樣品以N，N-二甲基甲酰胺溶解后直接進樣，經Agilent DB-5MS毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）分離，采用選擇離子掃描（SIM）模式定量分析。1-溴丙烷的質量濃度在131.8～1 758 ng/mL范圍內與色譜峰面積線性關系良好，相關系數為0.999 8，檢出限為0.40 μg/g，定量限為1.32 μg/g。樣品加標平均回收率為91.8%，測定結果的相對標準偏差為2.9%（n=6）。該方法簡單便捷、專屬性強、靈敏度高，可為鹵代烴類基因毒性雜質的痕量檢測提供方法參考。

 

關鍵詞： 替格瑞洛； 基因毒性雜質； 1-溴丙烷； 氣相色譜-質譜法； 鹵代烴

 

 

替格瑞洛為環戊基三唑嘧啶類藥物，可作用于P2Y12受體，減少二磷酸腺苷(ADP)結合位點[1]，進而抑制ADP介導的血小板聚集，是一種新型的血小板聚集抑制劑，為急性冠脈綜合征(ACS)首選藥物[2?3]。4，6-二氯-2-(丙硫基)-5-氨基嘧啶(DCPA)為替格瑞洛制備的關鍵中間體[4]，DCPA結構中丙硫基的形成涉及1-溴丙烷的親核取代，制備過程存在1-溴丙烷殘留風險(圖1)。

圖1   替格瑞洛合成示意圖

Fig. 1   Synthetic schematic diagram of Ticagrelor

基因毒性雜質是一類能直接或間接損傷細胞DNA，產生基因突變，誘導細胞癌變的化合物[5?6]。對于化合物基因毒性的風險評估，首先需要關注其是否具有警示結構，鹵代烷烴具有強的反應活性，可與DNA堿基發生親電反應，屬于警示性功能基團[7?8]。隨著藥物分析技術以及對基因毒性雜質認識的不斷發展，相關監管指南正逐步建立和完善，為消除臨床隱患，提升用藥安全性，有必要對DCPA中殘留的潛在基因毒性雜質溴丙烷進行測定和控制，以降低其在替格瑞洛中的殘留風險。

目前對溴丙烷的分析主要集中在職業衛生領域，研究對象涉及尿液、血液等生物樣本以及場所環境等，檢測方法包括氣相色譜(GC)法、頂空氣相色譜(HS-GC)法、氣相色譜-質譜(GC-MS)法和頂空氣相色譜-質譜(HS-GC-MS)法[9?12]，而醫藥領域鮮有相關報道，王靜文等[13]建立了頂空氣相色譜法測定鹽酸羅哌卡因原料藥中殘留的溴丙烷溶劑。有別于一般雜質，基因毒性雜質通常為痕量雜質，限度要求低，同時基因毒性雜質常含有活潑基團，穩定性較差[14]，此外，藥品復雜的成分也會對基因毒性雜質的檢測造成干擾[15]，因此，對于潛在基因毒性雜質1-溴丙烷而言，其分析方法的開發、驗證以及限度的制定均有待進行針對性地研究。筆者建立了GC-MS法測定DCPA中潛在基因毒性雜質1-溴丙烷，并進行了方法學研究，可為替格瑞洛的質量控制提供參考和依據。

 

1、 實驗部分

 

 

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜-質譜聯用儀：7890B-5977A型，美國安捷倫科技有限公司。

超聲波發生儀：S100H型，德國艾爾瑪公司。

電子分析天平：BSA224S型，感量為0.1 mg，德國賽多利斯公司。

甲醇、丙酮、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

1-溴丙烷標準品：純度(質量分數)為99.5%，上海安譜實驗科技股份有限公司。

DCPA樣品：純度(質量分數)為99%，批號011005，上海匯倫醫藥股份有限公司。

1.2 儀器工作條件

1.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent HP-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm，美國安捷倫科技有限公司)；載氣：高純氦氣，流量為1.0 mL/min；進樣口溫度：250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，維持5 min，以60 ℃/min的速率升溫至280 ℃，維持11 min；進樣體積：1.0 μL；分流比：5∶1。

1.2.2 質譜條件

離子源：電子轟擊離子源(EI)；電離能：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四極桿溫度：150 ℃；傳輸線溫度：280 ℃。掃描方式：全掃描(SCAN)模式定性，選擇離子掃描(SIM)模式定量，定量離子(m/z)122；1-溴丙烷的出峰時間：2.250 min。

1.3 實驗步驟

1.3.1 溶液配制

1-溴丙烷標準品溶液：精密稱取1-溴丙烷標準品約40 mg，置于100 mL容量瓶中，用DMF溶解并稀釋至標線，搖勻。精密量取上述1-溴丙烷溶液0.5 mL于250 mL容量瓶，用DMF稀釋至標線，搖勻，配制成質量濃度約為800 ng/mL的1-溴丙烷標準品溶液。

1-溴丙烷標準儲備液：取1-溴丙烷標準品適量，以DMF溶解并稀釋制成質量濃度為8.791 μg/mL的1-溴丙烷標準儲備液。

1-溴丙烷系列標準工作溶液：精密量取1-溴丙烷標準儲備液適量，以DMF分別稀釋制成質量濃度為131.8、263.7、439.6、879.1、1 319、1 758 ng/mL的系列標準工作溶液。

加標樣品溶液：分別取DCPA樣品和1-溴丙烷標準儲備液適量，以DMF超聲溶解并稀釋，制成DCPA的質量濃度為100 mg/mL、1-溴丙烷的質量濃度為879.1 ng/mL的加標樣品溶液。

樣品溶液：精密稱取DCPA樣品約1 g，置于10 mL容量瓶中，加入DMF超聲溶解并稀釋至標線，搖勻。

1.3.2 測定方法

在1.2儀器工作條件下，測定1-溴丙烷系列標準工作溶液，以1-溴丙烷質量濃度為橫坐標，以1-溴丙烷監測離子的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，用外標法定量。

 

 

2、 結果與討論

 

 

2.1 溶劑選擇

對于1-溴丙烷的檢測而言，尿液樣本通常以純化水為溶劑，血液樣本以甲醇為溶劑，紡織品以丙酮為提取劑和溶劑。1-溴丙烷和DCPA均不溶于水，甲醇、丙酮雖然溶解性較好，但是其色譜峰與1-溴丙烷色譜峰發生部分重疊，產生溶劑效應，影響方法的專屬性和靈敏度。為了避免溶劑干擾，選擇具有較高沸點且對DCPA和1-溴丙烷均具有較好溶解性的DMF為溶劑。

2.2 色譜條件選擇

基于1-溴丙烷較好的熱穩定性和易氣化的特性，采用簡單便捷的直接進樣方式進樣，同時，為了兼顧色譜峰形的改善和靈敏度的提高，采用分流進樣模式，分流比設置為5∶1。

分別比對了HP-5MS柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)和DB-624柱(30 m×0.25 mm，1.4 μm)兩種不同極性的色譜柱。結果表明，兩種色譜柱均能較好地分離1-溴丙烷，但在HP-5MS柱上的保留時間明顯小于DB-624柱，這與HP-5MS色譜柱較弱的極性和較小的膜厚有關。此外，為了避免直接進樣時樣品中殘留基質對測定結果的干擾，提高色譜柱的穩定性，通常需采用較高的柱溫，然而，鑒于DB-624柱較厚的膜層，其最高工作溫度僅為260 ℃，相反，HP-5MS柱擁有極低的柱流失，最高工作溫度為325 ℃。綜合考慮，選用HP-5MS柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)作為分析柱。

2.3 監測離子的選擇

在1.2.2質譜條件下，對1-溴丙烷標準儲備液進行全掃描測定(質量數范圍35～140 Da)，結果如圖2所示。

圖2   1-溴丙烷質譜圖

Fig. 2   Mass spectrum of 1-bromopropane

由圖2可以看出，在70 eV電壓下，1-溴丙烷主要呈現43、122、124三個質譜峰，分別對應于丙烷正離子、分子離子峰及相應溴的同位素峰。鑒于丙酮、乙酸乙酯等常用溶劑均含有特征離子峰43，為了避免溶劑干擾，同時兼顧檢測靈敏度，選擇122為定量離子。

2.4 雜質限度的確定

1-溴丙烷含鹵代烴警示結構，為潛在基因毒性雜質，需作為基因毒性雜質來控制。研究表明，1-溴丙烷主要表現為神經毒性和生殖毒性[11,16]，缺少致突變性、致癌性等毒理學試驗數據，為ICH M7 (R2)(國際人用藥品注冊技術協調會指導原則)指南中第3類基因毒性雜質，可采用毒理學關注閾值(TTC，1.5 μg/d)作為可接受攝入量，結合替格瑞洛的日最大用藥劑量180 mg，計算確定1-溴丙烷的限度為8 μg/g。

2.5 專屬性試驗

在1.2儀器工作條件，分別取空白DMF溶液、1-溴丙烷標準品溶液以及加標樣品溶液進樣檢測，結果如圖3所示。

 

圖3   DMF溶液、1-溴丙烷標準品溶液和加標樣品溶液色譜圖

Fig. 3   Chromatograms of DMF solution，1-bromopropane standard solution and spiked sample solution

 

由圖3可以看出，空白溶液和樣品溶液對1-溴丙烷的測定沒有干擾，標準品溶液和加標樣品溶液中的1-溴丙烷保留時間一致，表明方法具有良好的專屬性。

2.6 線性方程和檢出限

在1.2儀器工作條件，分別測定1-溴丙烷系列標準工作溶液，以1-溴丙烷質量濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標繪制標準工作曲線，擬合后的線性方程為y=57.023x+366.61，相關系數為0.999 8，表明1-溴丙烷的質量濃度在131.8～1 758 ng/mL范圍內與色譜峰面積具有良好的線性關系。

取適量1-溴丙烷標準品，用DMF溶解稀釋，配制成質量濃度分別為39.56、131.8 ng/mL的溶液作為檢出限和定量限溶液，以3倍信噪比對應的1-溴丙烷質量濃度作為檢出限，以10倍信噪比對應的1-溴丙烷質量濃度作為定量限。根據樣品質量和定容體積換算為樣品中的含量，以質量分數表示，得方法檢出限為0.40 μg/g (相當于限度濃度的5%)，定量限為1.32 μg/g (相當于限度濃度的16.5%)。方法的檢出限和定量限均小于限度要求，能夠滿足測定要求。

2.7 精密度試驗

取DCPA樣品適量，按1.3.1方法平行配制6份樣品溶液并測定，結果見表1。由表1可知，6次測定結果的相對標準偏差為2.9%，表明建立的方法具有良好的精密度。

表1   精密度試驗結果

Tab. 1   Precision test results

 

 

2.8 加標回收試驗

按1.3.1方法配制DCPA樣品溶液，配制過程中，精密加入適量1-溴丙烷標準儲備液，使溶液中待測1-溴丙烷的質量濃度分別為476、827、1 179 ng/mL，分別相當于50%、100%、150%的限度水平，測定結果見表2。由表2可知，1-溴丙烷的平均回收率為91.8%，表明該方法具有良好的準確度。

表2   加標回收試驗結果

Tab. 2   Test results of standard addition recovery

 

 

2.9 溶液穩定性試驗

取1-溴丙烷標準品溶液于室溫下放置，分別于

第0、1、2、16 h四個時間點取樣測定，結果見表3。由表3可知，1-溴丙烷色譜峰面積測定結果的相對標準偏差為1.4%，表明1-溴丙烷溶液在16 h內具有良好的穩定性。

表3   1-溴丙烷溶液穩定性試驗結果

Tab. 3   Stability test results of 1-bromopropane solution

 

3、 結語

 

 

建立了GC-MS法測定替格瑞洛關鍵中間體DCPA中潛在基因毒性雜質1-溴丙烷的方法，并進行了方法學驗證。該方法簡單便捷、專屬性強、靈敏度高，適用于DCPA中1-溴丙烷的檢測與控制，以降低其在終產品替格瑞洛中的殘留風險，提升質量可控性。此外，方法的建立也可為其他藥物或中間體中鹵代烴類基因毒性雜質的痕量檢測提供參考。

 

參考文獻：

1 WERNLY B，ERLINGE D，PERNOW J，et al. Ticagrelor：a cardiometabolic drug targeting erythrocyte-mediated purinergic signaling？［J］. American Journal of Physiology-heart and Circulatory Physiology，2021，320（1）：90.

 

2 COLLRT J，THIELE H，BARBATO E，et al. 2020 ESC Guidelines for the management of acute coronary syndromes in patients presenting without persistent ST-segment elevation［J］. Revista Espanola De Cardiologia，2021，74（6）：544.

 

3 朱伯謙，宋兵戰，陳凱，等. DNA甲基化調控p16表達在替格瑞洛改善血管內皮功能中的作用及機制［J］.南京醫科大學學報（自然科學版），2023，43（2）：169.

    ZHU Boqian，SONG Bingzhan，CHEN Kai，et al. The role and mechanism of ticagrelor on the vascular endothelial function through DNMT1/p16 signaling pathway［J］. Journal of Nanjing Medical University （Natural Sciences），2023，43（2）：169.

 

4 孫蘭天，王業明，閆紅.替格瑞洛的合成工藝優化［J］.中國醫藥工業雜志，2018，49（4）：445.

    SUN Lantian，WANG Yeming，YAN Hong. Improved synthesis of Ticagrelor［J］. Chinese Journal of Pharmaceuticals，2018，49（4）：445.

 

5 汪生，杭太俊.藥物中基因毒性雜質檢測策略的研究［J］.中國新藥雜志，2019，28（23）：2 840.

    WANG Sheng，HANG Taijun. Strategies for determination of genotoxic impurities in pharmaceuticals［J］. Chinese Journal of New Drugs，2019，28（23）：2 840.

 

6 姚彤，程青芳.鹽酸吉西他濱中甲磺酸酯類基因毒性雜質的GC-MS/MS測定［J］.化學試劑，2021，43（6）：806.

    YAO Tong，CHENG Qingfang. Simultaneous determination of genotoxic methanesulfonate impurities in gemcitabine hydrochloride by GC-MS/MS［J］. Chemical Reagents，2021，43（6）：806.

 

7 BENIGNI R，BOSSA C. Mechanisms of chemical carcinogenicity and mutagenicity：a review with implications for predictive toxicology［J］. Chemical Reviews，2011，111（4）：2 507.

 

8 張迪，曾令高，陳竹，等. GC-MS法測定鹽酸氯哌丁原料藥中的氯乙烷［J］.華西藥學雜志，2021，36（6）：703.

    ZHANG Di，ZENG Linggao，CHEN Zhu，et al. Determination of chloroethane in cloperastine hydrochloride by GC-MS［J］. West China Journal of Pharmaceutical Sciences，2021，36（6）：703.

 

9 戎偉豐，凌偉潔，胡嘉雯，等.氣相色譜法同時測定工作場所空氣中45種常見有機物［J］.中國職業醫學，2018，45（3）：363.

    RONG Weifeng，LING Weijie，HU Jiawen，et al. Simultaneous detection of 45 kinds of common organic compounds in workplace air by gas chromatography［J］. China Occupational Medicine，2018，45（3）：363.

 

10 鄭燁.頂空氣相色譜直接測定大鼠血樣中1-溴丙烷的方法及應用研究［D］.濟南：山東大學，2017.

    ZHENG Ye. Method and application research of using headspace gas chromatography to directly measure 1-BP concentration in rats blood［D］. Jinan：Shandong University，2017.

 

11 林寧婷，連秋燕，邱麗君，等.氣質聯用法測定紡織品中1-溴丙烷的含量［J］.紡織導報，2015，（5）：79.

    LIN Ningting，LIAN Qiuyan，QIU Lijun，et al. Determination of the content of 1-bromopropane in textiles via gas chromatography-mass spectrometric method［J］. China Textile Leader，（5）：79.

 

12 周麗屏，楊雪姬，郭嘉明，等.頂空-氣相色譜-質譜法測定人尿中1-溴丙烷［J］.中國職業醫學，2016，43（3）：350.

    ZHOU Liping，YANG Xueji，GUO Jiaming，et al. Determination of 1-bromopropane in human urine by headspace gas chromatography-mass spectrometry［J］. China Occupational Medicine，2016，43（3）：350.

 

13 王靜文，徐代月，左寧，等.頂空氣相色譜法測定鹽酸羅哌卡因原料藥中殘留溶劑［J］.中國藥師，2022，25（12）：2 290.

    WANG Jingwen，XU Daiyue，ZUO Ning，et al. Determination of residual solvents in ropivacaine hydrochloride by headspace gas chromatography［J］. China Pharmacist，2022，25（12）：2 290.

 

14 張霽，張英俊，聶飚.藥物研發中基因毒性雜質的控制策略與方法探索進展［J］.中國醫藥工業雜志，2018，49（9）：1 203.

    ZHANG Ji，ZHANG Yingjun，NIE Biao. Advances in control strategies and methods for genotoxic impurities in drug research & development［J］. Chinese Journal of Pharmaceuticals，2018，49（9）：1 203.

 

15 王建，周萍，劉貴君，等. HPLC-MS/MS分析阿哌沙班中基因毒性雜質及基質效應消除研究［J］.中國現代應用藥學，2022，39（10）：1 336.

    WANG Jian，ZHOU Ping，LIU Guijun，et al. Study on genotoxic impurities and elimination of matrix effect in apixaban by HPLC-MS/MS［J］. Chinese Journal of Modern Applied Pharmacy，2022，39（10）：1 336.

 

16 李宏玲，謝植偉，宋向榮，等. 1-溴丙烷母體暴露對雄性仔鼠神經毒性和血液毒性研究［J］.中國職業醫學，2021，48（3）：253.

    LI Hongling，XIE Zhiwei，SONG Xiangrong，et al. Neurotoxicity and hematotoxicity of maternal exposure to 1-bromopropane in male offspring rats［J］. China Occupational Medicine，2021，48（3）：253.