摘 要： 建立高效液相色譜法測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚片中硫脲的含量。樣品用流動(dòng)相提取后，用Shim-pack GIST C8色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離，以磷酸鹽緩沖液-甲醇（體積比為90∶10）為流動(dòng)相，等度洗脫，流量為0.5 mL/min，柱溫為40 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為236 nm，進(jìn)樣體積為10 μL。硫脲的質(zhì)量濃度在0.102～10.205 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)為0.999 9，方法檢出限為3.4 μg/g，定量限為8.5 μg/g。測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%（n=6），加標(biāo)平均回收率為99.3%。該方法處理簡(jiǎn)便，檢測(cè)高效，靈敏度高。

關(guān)鍵詞： 對(duì)乙酰氨基酚片； 硫脲； 高效液相色譜法

 

 

對(duì)乙酰氨基酚片是由對(duì)乙酰氨基酚和適量輔料組成的化學(xué)藥品，主要用于解熱鎮(zhèn)痛，屬于非處方藥物(OTC)[1?7]，是基礎(chǔ)公衛(wèi)體系必備藥物之一。全國(guó)共有901個(gè)對(duì)乙酰氨基酚片批文，是典型的同名多組方藥品，除主藥成分相同外，因企業(yè)不同，其輔料的種類和用量均不相同，其中多用到玉米淀粉、預(yù)膠化淀粉、滑石粉、硬脂酸鎂等，有部分企業(yè)在輔料中使用了硫脲。硫脲對(duì)人體具有一定的毒性，被人體吸收后，對(duì)人體的甲狀腺以及造血器官造成抑制作用，從而導(dǎo)致心臟衰竭。有數(shù)據(jù)顯示，從事硫脲生產(chǎn)的工人常常出現(xiàn)頭痛、渾身乏力、上腹部疼痛，甚至出現(xiàn)面部腫脹、基礎(chǔ)代謝水平降低、白細(xì)胞數(shù)量減少等癥狀[8]。2017年10月27日，硫脲被世衛(wèi)組織國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為3類致癌物清單中。《中華人民共和國(guó)藥典》 (以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》) 2020年版二部和YBH06652020《國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)》中均未對(duì)對(duì)乙酰氨基酚片中硫脲作相應(yīng)的規(guī)定。企業(yè)也未曾建立相應(yīng)的質(zhì)控文件或標(biāo)準(zhǔn)，僅依據(jù)HG/T 3454—2013《化學(xué)試劑　硫脲》對(duì)入廠輔料進(jìn)行檢驗(yàn)，因此目前對(duì)乙酰氨基酚片中硫脲含量的控制存在一定的安全風(fēng)險(xiǎn)。

依據(jù)GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)　食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》，硫脲不能作為食品添加劑使用。而硫脲作為藥用輔料，目前尚未收載《中國(guó)藥典》，僅在2022年，國(guó)家藥典委員會(huì)網(wǎng)站公布硫脲輔料征求意見(jiàn)稿，將硫脲作為抗氧劑使用。由于硫脲對(duì)人體具有一定的毒性，存在較大的用藥安全隱患，需要建立對(duì)乙酰氨基酚片中硫脲的分析方法，以便進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估及監(jiān)測(cè)。目前關(guān)于硫脲分析方法的報(bào)道主要為高效液相色譜法或液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[9]，主要集中于化工染料、面粉及其制品中硫脲的分析，而藥品中硫脲的檢測(cè)未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。筆者采用高效液相色譜法，將固定相C18色譜柱改為C8色譜柱，通過(guò)調(diào)整流量及流動(dòng)相比例，解決了硫脲在色譜柱上的保留值小的問(wèn)題。在樣品處理方面，充分考慮對(duì)乙酰氨基酚及對(duì)氨基酚特性，在色譜法分析時(shí)，加入一定量的離子對(duì)試劑，以獲得對(duì)稱完整的色譜峰；利用硫脲易溶于水溶液的特性，采用流動(dòng)相作為提取溶劑，既滿足了對(duì)硫脲的提取，又確保了對(duì)乙酰氨基酚片中對(duì)乙酰氨基酚及對(duì)氨基酚有效檢出。該方法可為對(duì)乙酰氨基酚片中硫脲質(zhì)量控制及風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供參考。

 

 

1、 實(shí)驗(yàn)部分

 

 

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Aglient 1260型，配紫外檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

電子天平：BP211D型，感量為0.1 mg，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司。

超聲波清洗器：SB25-12DTD/V型，寧波新芝生物科技股份有限公司。

磷酸二氫鈉：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

40%的四甲基氫氧化銨溶液：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

甲醇、乙腈：均為色譜純，美國(guó)默克公司。

硫脲對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為100.0%，批號(hào)為410002-201201，中國(guó)食品藥品鑒定研究院。

對(duì)氨基酚對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為100.0%，批號(hào)為100802-202005，中國(guó)食品藥品鑒定研究院。

對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品：純度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為99.9%，批號(hào)為100018-202111，中國(guó)食品藥品鑒定研究院。

實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

對(duì)乙酰氨基酚片樣品：共9批，均為吉林省四平市食品藥品檢驗(yàn)所2022年監(jiān)督抽驗(yàn)專項(xiàng)任務(wù)抽驗(yàn)樣品，基本信息見(jiàn)表1。

表1   對(duì)乙酰氨基酚片信息

Tab. 1   Paracetamol tablets information

 

1.2 儀器工作條件

色譜柱：Shim-pack GIST C8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，日本島津儀器有限公司)；柱溫：40 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm；進(jìn)樣體積：10 μL；流動(dòng)相：磷酸鹽緩沖液-甲醇(體積比為90∶10，下同)，流量為0.5 mL/min；洗脫方式：等度洗脫。

1.3 溶液配制

磷酸鹽緩沖液：稱取磷酸氫二鈉8.95 g，磷酸二氫鈉3.9 g，加水溶解至1 000 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的四丁基氫氧化銨溶液12 mL，混勻。

系統(tǒng)適用性溶液：分別準(zhǔn)確稱取硫脲、對(duì)氨基酚和對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品各10 mg，置于同一100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻；準(zhǔn)確移取上述溶液5 mL，置于10 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，搖勻。

硫脲對(duì)照品溶液：10 μg/mL，準(zhǔn)確稱取硫脲對(duì)照品約20.41 mg，置于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并稀釋至標(biāo)線，搖勻；準(zhǔn)確移取上述溶液2.5 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至，搖勻。

硫脲系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：準(zhǔn)確量取硫脲對(duì)照品溶液1、4、2、4、10 mL，分別置于100、100、10、10、10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，搖勻，得硫脲系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)量濃度依次為0.102、0.408、2.041、4.082、10.205 μg/mL。

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取20片對(duì)乙酰氨基酚片的質(zhì)量，并計(jì)算平均片重，研細(xì)備用。稱取對(duì)乙酰氨基酚片細(xì)粉適量(約含對(duì)乙酰氨基酚0.1 g)，置于10 mL容量瓶中，加入流動(dòng)相適量，振搖溶解，用流動(dòng)相稀釋至標(biāo)線，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為樣品溶液。

1.5 測(cè)定方法

取系統(tǒng)適用性溶液、硫脲系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液和樣品溶液，按照1.2儀器工作條件分別進(jìn)行測(cè)定。系統(tǒng)適用性要求：理論板數(shù)按照硫脲色譜峰計(jì)算，不低于8 000，硫脲、對(duì)氨基酚、對(duì)乙酰氨基酚色譜峰之間的分離度均不小于3.0。以色譜峰面積外標(biāo)法計(jì)算硫脲相對(duì)主成分含量。

 

2、 結(jié)果與討論

 

2.1 色譜柱選擇

由于硫脲在色譜柱上保留值較小，優(yōu)選C8色譜柱，并將流量降低至0.5 mL/min，以增加其在色譜柱上的保留值。分別比較了Carpisil C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、InerSustain C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、BDS HypersilTM C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)、Shim-pack GIST C8柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)四種型號(hào)色譜柱的分離效果，結(jié)果均滿足系統(tǒng)適用性要求，相同條件下Shim-pack GIST C8色譜柱獲得的色譜圖中對(duì)氨基酚與對(duì)乙酰氨基酚色譜峰對(duì)稱性更好(如圖1所示)，且硫脲色譜峰理論板數(shù)更高，故選擇Shim-pack GIST C8色譜柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)。

 

圖1   系統(tǒng)適用性溶液色譜圖

Fig. 1   System suitability solution chromatogram

2.2 柱溫選擇

選用Shim-pack GIST C8色譜柱，考察柱溫分別為35、40、45 ℃時(shí)硫脲的測(cè)定結(jié)果。結(jié)果表明，除保留時(shí)間不同外，硫脲的測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯差異。當(dāng)柱溫為35 ℃時(shí)，系統(tǒng)適用性溶液色譜圖中，對(duì)氨基酚和對(duì)乙酰氨基酚色譜峰拖尾因子較大；當(dāng)柱溫為45 ℃時(shí)，硫脲與對(duì)氨基酚色譜峰分離度為3.1；當(dāng)柱溫為40 ℃時(shí)，硫脲與對(duì)氨基酚色譜峰分離度為4.6。綜合考慮，選擇柱溫為40 ℃。

2.3 流動(dòng)相選擇

液相色譜法測(cè)定硫脲時(shí)，流動(dòng)相可以選擇甲醇-乙腈-水(5∶5∶90)、磷酸二氫銨(用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.0)-甲醇(98∶2)和乙腈-水(梯度洗脫)[10?15]。由于硫脲相對(duì)分子質(zhì)量較小，其結(jié)構(gòu)式存在C=S和—NH2，應(yīng)首選極性較大的流動(dòng)相。對(duì)乙酰氨基酚和對(duì)氨基酚分子結(jié)構(gòu)中存在苯環(huán)與氮?dú)滏I的共軛體系，選擇流動(dòng)相時(shí)考慮加入離子對(duì)試劑，以增加色譜峰的對(duì)稱性。參考《中國(guó)藥典》2020年版二部中對(duì)乙酰氨基酚片項(xiàng)下對(duì)氨基酚檢測(cè)方法及有關(guān)物質(zhì)分析的流動(dòng)相，分別選擇磷酸鹽緩沖液(磷酸氫二鈉8.95 g、磷酸二氫鈉3.9 g，加水溶解至1 000 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的四丁基氫氧化銨溶液12 mL)-甲醇(90∶10)和甲醇-緩沖液(磷酸氫二鈉十二水合物8.96 g、磷酸二氫鈉二水合物3.91 g溶于1 000 mL水中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%的四丁基氫氧化銨溶液1.53 g) (10∶90)兩種流動(dòng)相體系進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種流動(dòng)相均可以將硫脲、對(duì)氨基酚和對(duì)乙酰氨基酚有效分離，但是，前者獲得的對(duì)氨基酚色譜峰對(duì)稱性更好，故選擇磷酸鹽緩沖液-甲醇(90∶10)為流動(dòng)相。

2.4 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

取對(duì)氨基酚、對(duì)乙酰氨基酚和硫脲對(duì)照品，用體積分?jǐn)?shù)為40%甲醇溶液分別配制成質(zhì)量濃度均為1.0 μg/mL的溶液，采用島津UV-2450型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)進(jìn)行光譜掃描。結(jié)果表明，對(duì)氨基酚的最大吸收波長(zhǎng)為233 nm和301 nm；對(duì)乙酰氨基酚最大吸收波長(zhǎng)為248 nm；硫脲最大吸收波長(zhǎng)為236 nm。

取系統(tǒng)適用性溶液，按照1.2儀器工作條件，利用DAD紫外檢測(cè)器在200～400 nm范圍內(nèi)對(duì)對(duì)氨基酚、對(duì)乙酰氨基酚和硫脲掃描。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)氨基酚最大吸收波長(zhǎng)變?yōu)?32 nm和298 nm；對(duì)乙酰氨基酚最大吸收波長(zhǎng)變?yōu)?44 nm；硫脲最大吸收波長(zhǎng)依然為236 nm，由此可見(jiàn)，當(dāng)加入四丁基氫氧化銨后，影響了分子內(nèi)電子云排布，導(dǎo)致最大吸收波長(zhǎng)的位移，而硫脲分子結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，則不受影響，故選擇236 nm作為檢出波長(zhǎng)。

2.5 樣品處理方法優(yōu)化

由于硫脲易溶液于水，在溶劑的選擇過(guò)程中，分別考察水、40%甲醇溶液和流動(dòng)相作為提取溶劑的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種提取溶劑均可將硫脲完全提取出來(lái)，但是以水作為提取溶劑時(shí)，對(duì)氨基酚和對(duì)乙酰氨基酚的提取效果不盡理想；以40%甲醇溶液和流動(dòng)相為提取溶劑時(shí)，兩者的提取效果類似，但40%甲醇溶液會(huì)出現(xiàn)溶劑效應(yīng)，影響硫脲和對(duì)氨基酚色譜峰的對(duì)稱性，因此選擇流動(dòng)相作為提取溶劑。

分別比較了振搖和超聲兩種提取方式，提取時(shí)間均分別為5 min和10 min。結(jié)果表明，振搖5 min與超聲5 min時(shí)，對(duì)硫脲、對(duì)氨基酚和對(duì)乙酰氨基酚的提取效果一致。兩種提取方式10 min的提取效果與5 min一致，考慮提取操作性及能耗因素，優(yōu)選振搖作為提取方式。當(dāng)溶劑充分接觸藥粉時(shí)，適當(dāng)振搖即可完全提取，故提取時(shí)間不做具體規(guī)定。該處理方法獲得的樣品溶液分別于第0、2、4、6、8、12、24 h時(shí)，在1.2色譜條件下進(jìn)樣分析，硫脲色譜峰面積測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.1%，表明該方法處理的樣品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 專屬性試驗(yàn)

取A企業(yè)提供的輔料，按照A樣品規(guī)格及片重，除硫脲外，稱取100片量的陰性原輔料，并充分混勻，得陰性樣品。按照1.4方法處理，得陰性樣品溶液。取硫脲對(duì)照品溶液、陰性樣品溶液、加標(biāo)樣品溶液，在1.2儀器工作條件下分別進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可以看出，陰性輔料在硫脲色譜峰保留時(shí)間處無(wú)干擾，硫脲與對(duì)乙酰氨基酚充分分離，該方法專屬性良好。

 

2.7 線性方程和檢出限

在1.2儀器工作條件下，分別測(cè)定硫脲系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以硫脲質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。硫脲的質(zhì)量濃度在0.102～10.205 μg/mL范圍內(nèi)與色譜峰面積有良好的線性關(guān)系，線性方程為y=177.511x+3.895，相關(guān)系數(shù)為0.999 9。

在陰性樣品中加入低濃度的硫脲標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4方法進(jìn)行樣品處理，在1.2儀器工作條件下測(cè)定，計(jì)算硫脲色譜峰信噪比，分別以3倍和10倍信噪比對(duì)應(yīng)的樣品中硫脲的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為方法檢出限和定量限，對(duì)乙酰氨基酚片中硫脲的檢出限為3.4 μg/g，定量限為8.5 μg/g。

2.8 精密度試驗(yàn)

取A公司批號(hào)為211207的樣品，按照1.4樣品處理方法，平行制備6份樣品溶液，在1.2色譜條件下測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，6次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.8%，表明該方法精密度良好。

表2   精密度試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 2   Precision test results

 

2.9 加標(biāo)回收試驗(yàn)

精密稱取陰性樣品約0.12 g，置于10 mL容量瓶中，精密加入質(zhì)量濃度為10.205 μg/mL的硫脲對(duì)照品溶液2 mL，按照樣品溶液同法處理6份加標(biāo)樣品溶液，在1.2儀器工作條件下測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知，加標(biāo)平均回收率為99.3%，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表3   加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

Tab. 3   Results of spiked recoveries test

 

 

 

3、 結(jié)語(yǔ)

 

 

建立了高效液相色譜測(cè)定對(duì)乙酰氨基酚片中硫脲含量的分析方法。該方法專屬性、精密度、重復(fù)性和準(zhǔn)確度良好，操作簡(jiǎn)便，可為對(duì)乙酰氨基酚片的安全用藥和標(biāo)準(zhǔn)完善提供依據(jù)。

 

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