原輔料粒徑是制藥過程中的關鍵質量指標，對于確保藥物穩定性、生物利用度和療效具有至關重要的作用。大部分原料藥的粒徑大小對其療效有著顯著的影響，因為它會直接影響到藥物在體內的吸收、分布、代謝和排泄過程。例如恩替卡韋的體內藥代動力學表現出粒徑大小的依賴性，粒徑越小，全身暴露量越大，0.8微米大小的顆粒比6.3、15.3和22.6微米大小的全身暴露量分別高1.6、3.6和5.6倍。另一個代表性藥物是帕利哌酮長效注射液，目前上市的三種注射液給藥頻率分別為1月1次，3月1次和6月1次，在帕利哌酮注射液中，粒徑的大小直接影響了藥物在肌肉中的釋放速度。顆粒越小，釋放越快。因此，合適的粒徑分布是發揮理想緩釋作用的關鍵。（圖1）

圖1：帕利哌酮注射液不同療效制劑顯微鏡下粒徑差異

中國藥典2020版第四部通則<0982粒度和粒度分布測定法>中規定了三種方法測定原料藥和藥物制劑的粒子大小或粒度分布，其中第一法、第二法用于測定藥物制劑的粒子大小或限度，第三法用于測定原料藥或藥物制劑的粒度分布。第一法即顯微鏡法，第二法即篩分法，篩分法又分為手動篩分法、機械篩分法與空氣噴射篩分法。第三法又稱為光散射法，即利用光束照射到顆粒供試品后發生散射現象，通過測量散射光的能量分布，依據米氏散射或弗朗霍夫理論計算顆粒粒度分布。本文將上述三種方法及其他常見的粒徑研究手段進行簡要概述與總結，并對粒徑研究手段的選擇給出建議，希望能對大家粒徑研究有所幫助，從而根據自己的實際需求篩選合適的方式。

 

一、篩分法

篩分法是利用篩孔將粉體機械阻擋的一種分級方法，通過將篩孔大小不同的篩網疊放在一起，對樣品進行篩分，粒徑小于篩孔的顆粒漏過篩網，大于篩孔的顆粒截留在篩網上，然后通過稱量不同篩子剩余樣品的質量，從而得到以篩網孔徑為界限樣品的粒徑大小及分布范圍。（圖2）

圖2：篩分法示意圖

測量方式：干法、濕法、空氣噴射篩分。

測量范圍：一般適用于粒徑大于75μm的顆粒。

優點：篩分原理簡單、直觀，操作方便，易于實現。

缺點：

①對于篩網孔徑的大小未能形成統一標準，不同國家有不同的標準。

 

②物料使用量大，篩分法的物料用量為25g~100g。

 

③篩網本身的區分力有限，一般僅適用于粒徑大于75μm（粉體中80%的粒子的粒徑大于75μm）的顆粒。

 

④篩分精度低，受制于篩網孔徑的劃分，粒徑范圍的劃分往往較寬。

 

⑤誤差大，顆粒形狀、靜電、測試條件、測試環境等因素都會造成較大的測量誤差，此外反復使用導致的篩網拉伸、清洗不當造成的篩孔堵塞也會引起測量誤差。

 

二、顯微鏡法

光學顯微鏡對顆粒進行直接觀察是更直接，更簡單的方式。普通的顯微鏡測量粒徑范圍一般是0.2~100μm，如果想要測量更小的粒徑，則可以選擇更為精密的儀器進行觀察，如掃描電鏡、原子力顯微鏡等。這種直觀的測量方式可以得到更為精準的與尺寸相關的信息，例如顆粒的形態等（圖3）。

圖3：某原料藥不同晶型在電鏡下的區別

使用顯微鏡觀察顆粒時，如圖2所示，顆粒往往不是球形，并且多不規則，難以采用統一的方法對粒徑進行描述。目前主流的方式是計算顆粒在二維平面上投影面積，并轉換為面積等效圓的直徑。一般可借助圖形統計分析軟件，如Image Pro Plus（IPP）等，對拍攝圖像中的顆粒進行識別、測量和統計，最終得到視野范圍內顆粒的等效圓粒徑的分布。

優點：

①可以直觀觀察顆粒的形狀、結構及表面形貌。

 

②測量單個粒子直徑和觀察形態時更方便直接。

缺點：

①人工統計顆粒時，更容易關注大顆粒，而忽視小顆粒，從而影響測量結果的準確性。

 

②小顆粒容易聚集，分析軟件自動統計時難以區分，會高估實際的粒徑。

 

③顯微鏡獲得的視野表現的是顆粒的二維尺寸，無法表征其高度。

 

④顯微鏡視野有限，當樣品取樣不均勻或視野選取不具有代表性時，測試結果可能有較大偏差。

雖然傳統顯微鏡方法存在局限性，但隨著高速數碼相機、計算機技術飛速發展，自動化圖像分析儀器如新帕泰克粒度粒形分析儀應運而生，即在傳統顯微鏡的基礎上引入了先進的分散系統、高性能鏡頭和智能分析軟件。這些儀器能夠捕捉到靜止或運動狀態下顆粒的二維圖像，（圖4）儀器將拍攝到的圖像進行分析，并將其轉換為相應的粒徑分布數據。使得測量更方便快捷且準確。

圖4：動態顆粒圖像分析儀工作原理示意圖與捕捉到的二維圖像

 

三、激光衍射法

當激光束照射在分散于空氣流或液體介質中小顆粒上時，發生衍射和散射，從而產生光強的空間分布化。激光粒度儀利用光電探測器接收這些光信號，轉化為電信號后利用數學模型來擬合出粒子的粒度分布情況。（圖5）簡單來說，顆粒的衍射角度取決于顆粒粒度大小，大顆粒衍射角度小，光強高。小顆粒衍射角度寬，光強弱，（圖6）通過分析樣品衍射角度和光強信息，并一系列復雜的計算，可以推導出顆粒等效體積徑的分布信息。

圖5激光衍射法基本工作原理

圖6：不同粒徑顆粒激光衍射的區別

激光粒度分析技術以其卓越的測量能力，成為科研工作者手中的重要工具，在此，以代表性工具新帕泰克激光粒度儀為例，對粒徑結果進行解析（圖7）。

圖7新帕泰克測量的粒徑結果

結果主要由以下幾部分構成：①如注釋1所示顯示了粒徑測定的運算方式為FREE氏，適用于完全不透明的和大顆粒的測量；另一種米氏理論需要了解顆粒的光學特性才能更好的計算，且更適用于較小顆粒的測量。②注釋2顯示了粒徑分布中的關鍵粒徑，X50 =5.10μm：表示在該被測試的樣品中，粒徑小于5.10μm顆粒占總體積的50％；X90=24.49μm：表示在該被測試的樣品中，粒徑小于24.49μm顆粒占總體積的90％；SMD表示表面積平均粒徑，VMD表示體積平均粒徑；Copt表示光學濃度，是指探測器上光強衰減量與無顆粒時的光強之比。③注釋3表示了粒徑分布的圖譜，Q3為累積分布函數，定義為粒度小于Xi的顆粒總體積占全部顆粒總體積的比值，從圖譜中可以直觀、快速地觀察數據的分散程度和中心趨勢。Q3是最常用的體積分布，在輸出結果時可以根據需要選擇數量分布或者其他分布等。④注釋4顯示了詳細的累積分布和頻數分布數值，從累積分布數據可以看出，這批顆粒的最大粒徑在246μm。⑤結果中還詳細展現了測量中的具體參數、觸發條件和分散方法，在系統部分可以看出測量采用的儀器、分散系統和采用的鏡頭。

測試范圍：0.01-3500μm，適用于絕大多數粉末、乳液、懸浮液等樣品。

優點：樣品用量小、測定方便、快速、重現性較高

缺點：

①由于取樣量少，樣品難以代表整個批量的真實分布情況，需要對取樣有一定要求。

 

②激光散射法測量粒徑，一般需要設置顆粒的折射率、吸收率的參數。這些參數的設置極大地影響粒徑測定結果的可靠性。但是樣品的折射率等參數往往并不容易獲得，在實踐情況中，往往是根據測試者的經驗，設定通用參數。

 

③對濕度有一定要求，濕度變化會影響粉末的流動性和團聚性，進而影響測量結果。

 

④質地較脆的顆粒在測量過程中顆粒可能破裂，導致測量結果偏小。

 

⑤如果粉末中存在尺寸差異很大的顆粒，測量儀器可能難以準確識別所有顆粒，導致結果失真。

測量方式：干法、濕法

適用干法的情況：

①顆粒易分散而不被打碎。

 

②樣品可以懸浮在空氣流中。

適用于濕法的情況：

①材料有一定的危險性，如有毒，易暴等等

 

②樣品黏性高，且不易分散或者為濕粉狀態。

 

③樣品非常細(比如小于1微米)—當顆粒越小，團聚力越大，顆粒團聚在一起氣流難以分散。

 

④樣品顆粒易碎。

 

四、沉降法

沉降法是通過測量顆粒在介質中的沉降速度來反映粉體粒度分布的一種方法。顆粒沉降滿足Stokes定律，顆粒沉降速度與粒徑的平方成正比。（圖8）在介質中大顆粒沉降速度快，小顆粒沉降速度慢。該定律適用于各種大型不規則形狀的粒子，但所測得粒徑及分布只能看做等效沉速徑及分布（即與所測顆粒具有相同沉降速度的同質球形顆粒的直徑）。

圖8：Stokes定律

測試范圍：0.1-150μm。適合于各類粉體顆粒的粒徑測試。

沉降法在制藥領域應用較少，主要用于學術研究，以幫助人們理解斯托克斯定律的原理。

 

五、電阻傳感法

即電感應區原理，又稱庫爾特原理，是一種基于導電孔徑阻抗變化來測量顆粒尺寸的技術(圖9)。簡單來說，兩個裝有電解質的容器之間開一個小孔，當液體流過時，顆粒會通過小孔，使孔徑的導電面積減小，孔徑處的電阻與孔徑的導電面積成正比，這個信號變化可以反映出顆粒的大小。通過快速測量電阻脈沖的時間和幅度，我們可以計算出顆粒數量和體積。

圖9：庫爾特計數器工作原理示意圖

優點：

①分辨率高。庫爾特計數器是一個一個測出各顆粒的粒度，然后再統計粒度分布的，它能分辨各顆粒粒徑的微小差異，分辨率很高。

 

②重復性高、測量速度快、操作簡單。

缺點：

①經常發生小孔堵塞的情況，影響測量精度。

 

②樣品分析范圍小，檢測范圍取決于所使用的孔徑管，每個管只能測量其標稱孔徑直徑2~60%范圍內的顆粒。

 

③待測材料必須是非導電且無孔的，否則會影響測量結果，多孔顆粒測定的尺寸會比目測尺寸小得多。

 

④顆粒濃度要控制在儀器允許的范圍內，通常不超過每秒10,000個顆粒。

 

⑤小孔管和電解液需要經常進行校正。

 

六、動態光散射

動態光散射，也就是DLS。當光通過膠體時，粒子會將光散射，從而被一定角度下的檢測器檢測。由于粒子實時進行的布朗運動，產生的散射光會隨時間變化而波動，檢測器將散射光信號轉化為電信號，再通過一系列運算處理，得到顆粒的粒徑及其分布（圖10）。

圖10：動態光散射檢測原理

DLS生成的基礎粒徑分布是光強度分布，也可以進一步轉化為體積分布和數量分布。如圖（11）顯示了蛋白質粒徑測定代表性結果，其中關鍵的信息有平均粒徑與分布系數(particle dispersion index,PDI)，如圖平均粒徑Z-Average（±SD）為5.403±3.245nm，PDI為0.361。PDI體現了粒子粒徑均一程度，是粒徑表征的一個重要指標。分布系數<0.05：表明為單分散體系，如一些乳液的標樣；分布系數<0.08：表明為近單分散體系，但動態光散射只能用一個單指數衰減的方法來分析，不能提供更高的分辨率；分布系數0.08-0.7：適中分散度的體系，運算法則的最佳適用范圍；分布系數>0.7：尺寸分布非常寬的體系，很可能不適合光散射的方法分析。

圖11：粒徑代表性結果

測試范圍：0.4nm -10μm，適合所有能夠穩定存在于溶液中做布朗運動的顆粒。典型體系包括：乳液，有機/無機顆粒，自然/合成高分子溶液，表面活性劑，病毒，蛋白質樣品等。

優點：

①準確、快速、可重復性好，已經成為納米科技中比較常規的一種表征方法。

 

②對每個顆粒濃度峰值進行簡單、不受材料影響的測量，測量對象種類多。

 

③樣品制備簡單，需求量低。

缺點：

①對分散介質有一定要求，要求透明、與顆粒有不同的折光系數、掌握準確折光系數與粘度。

 

②對粒徑有一定要求，顆粒必須進行布朗運動，不能有沉淀行為。

 

總結

檢測手段多種多樣，在實際檢測中，需要根據自己的產品類型和目的選擇合適的檢測手段。不同的方式具有不同的優缺點，例如不同的檢測手段測得的粒徑具有不同的意義，例如篩分法、沉降法、激光衍射法、電阻法，他們測定的結果屬于統計學的結果，代表性強，動態范圍寬；而顯微鏡法，包括粒度粒形分析，雖然分辨率高，但是代表性差。除此之外，選擇方法時更主要的是關注目標顆粒的粒度范圍，不同的劑型和給藥方式的藥物顆粒有不同的粒度范圍，如圖12所示，我們可以根據不同方法的粒度適用范圍來選擇合適的方法。（圖13）

圖12：不同的劑型和給藥方式的藥物顆粒粒徑范圍

圖13不同檢測方法適用的粒度范圍

 

參考文獻

 

1、中國藥典2020版四部0982粒度和粒度分布測定法

 

2、Shekunov, B.Y., Chattopadhyay, P., Tong, H.H.Y. et al. Particle Size Analysis in Pharmaceutics: Principles, Methods and Applications. Pharm Res 24, 203–227 (2007). https://doi.org/10.1007/s11095-006-9146-7

 

3、動態顆粒圖像分析儀介紹http://www.sympatec.net.cn/Products-2576755.html

 

4、馬爾文粒度儀培訓材料

 

5、庫爾特計數器培訓材料

 

6、Zetasizer Nano 系列粒度電位儀快速操作手冊

 

7、新帕泰克粒徑儀培訓材料