前言

高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GC）是制藥行業分析檢測的主要手段，其中HPLC的運用更加廣泛，常見的包括正相色譜法（NPLC）、反相色譜法（RPLC）、離子交換色譜法（IEC）、親水作用色譜法（HILIC）等，是分析工作者首當其沖需要掌握的一門技術。

高效液相色譜儀由高壓輸液泵、進樣器、色譜柱、檢測器、積分儀或數據處理系統組成圖片。要做好HPLC分析方法開發，其中的關鍵組成部分（進樣系統、分離系統、檢測器）的基礎知識必須掌握。

筆者此文圍繞上述關鍵組成部分展開，旨在分享一些HPLC分析方法開發必備的基礎知識點。

知識點1-檢測器

檢測器是觀測化合物出峰的“眼睛”，“選定檢測器”則是HPLC方法開發的第一起點，不同的檢測器類型對應著方法可能達到的靈敏度上限、可選擇的流動相范圍（是否揮發性）、可選擇的洗脫方式（梯度洗脫/等度洗脫）、操作是否便捷、實驗的成本及方法轉移的成本，一旦選定了檢測器類型，就意味著方法開發的外邊界確定了（比如：選定了ELSD，則流動相不可含用磷酸鹽等非揮發性成分；選定了RID，則不建議采用梯度洗脫程序）。

因此，檢測器的選擇尤為關鍵，要做好分析方法開發，常見的檢測器原理、適用范圍、使用限制必須了解，下圖可做參考圖片。

讀者應結合實際情況，如“是否為痕量測定、待分離組分的復雜程度、待測化合物的性質（是否有紫外吸收、是否為可激發熒光的物質）、實驗室已有的設備資源、轉移實驗室的設備資源”綜合考慮。

知識點2-進樣系統

進樣系統不是影響分析方法開發成敗的關鍵點，但不合適的進樣系統，必然成為分析方法開發路上的絆腳石。

進樣系統的關鍵在于“進樣溶劑、進樣體積、進樣溫度以及洗針溶液”。

進樣溶劑，即供試品的稀釋溶劑，在滿足樣品溶解度和溶液穩定性的情況下，以初始比例流動相作為首選進樣溶劑，以避免溶劑效應的產生，如需采用其他進樣溶劑，應考慮溶劑的洗脫強度、溶劑的pH及其緩沖能力。

進樣體積過小，影響進樣精密度和靈敏度；進樣體積過大，降低分離效果、甚至會因為體積過載從而導致峰平頭。針對幾種不同的色譜柱構造，它們的最大建議進樣體積見下表圖片，其他規格的色譜柱可參考下表進行調整。

進樣溫度指的是控溫盤的溫度，僅在供試品溶液需要低溫條件以保持穩定的情況下才開啟。方法開發過程中，采用一個已經變壞的供試品溶液（雜質譜發生變化，不具代表性）是大忌。

洗針溶液通常采用不含鹽的初始比例流動相，反相色譜洗針液也常用50%甲醇-水溶液，若產生進樣殘留，可以結合殘留物的溶解性質適當增減有機相比例或者調節洗針液的酸堿性。

知識點3-分離系統

分離系統是HPLC分析方法開發的靈魂。分離系統不是色譜柱的獨舞，而是色譜柱、流動相、待測樣品等共同譜寫的交響樂。

待測樣品通常需要掌握其組分的復雜程度（基質、待測組分的數量）用于判斷樣品是否需要經過特殊的前處理、是否優先考慮梯度洗脫。化合物的pKa、logP（商業化軟件ACD可以給出pH-logD曲線，直觀展現化合物在不同pH條件下的親脂性）用于評估化合物的保留能力、輔助分離模式篩選、提供流動相緩沖溶液的pH選擇依據。化合物的分子量用于選擇匹配的色譜柱孔徑，孔徑大小在8~12nm的全孔和表面多孔的顆粒最常用于分子量小于10000Da 的分子，大于10000Da的分子通常采用30nm孔徑的色譜柱圖片。

流動相通常涉及以下幾個方面：流動相pH（視情況選擇具有緩沖能力的緩沖鹽，以保證化合物穩定的分子-離子形態，防止保留時間飄移；特殊情況如需改善峰形和保留，可能還需要使用離子對，一旦使用離子對就需要專柱專用）；有機相種類（反相色譜中最常用的是甲醇和乙腈，乙腈的洗脫強度大于甲醇，甲醇的氫鍵作用更強、乙腈還可提供偶極作用）；等度或梯度洗脫（依據待測組分的復雜程度和實際分離效果選擇）。

色譜柱的選擇可以從以下方面考慮：色譜柱的固定相種類（分離模式是反相/正相/HILIC/手性/離子交換，選擇與分離模式匹配的色譜柱，其中反相色譜柱種類繁多，重點關注基質類型、是否封端、鍵合官能團等）、粒徑（粒徑越小，柱效越高，但背壓越大）、孔徑（選擇與化合物分子量匹配的孔徑）、比表面積（比表面積越大，鍵合相覆蓋率越高，保留能力、柱容量、柱效越高）、碳載量（碳載量越高，疏水保留能力越高）、柱溫（一般情況下，柱溫升高，出峰變快，峰寬越窄，分離效果更好，可設計具體實驗觀測柱溫對實際分離效果的影響，注意實驗溫度不要超過色譜柱的耐受范圍）。市面上的色譜柱很多，如何從成百上千的色譜柱中選出心儀的色譜柱確實是個技術活，我們也不可能一根根的去盲試，故而需要分析工作者具備一定的判斷能力，除了考量上述廠家給出的色譜柱參數，反相色譜柱還可以利用一些標準化的數據庫進行柱篩選，如USP網站上的柱參數（基于疏水減法模型，將色譜柱作用力歸結為疏水作用、氫鍵作用、離子作用、形狀選擇作用），擁有ACD軟件的企業則可以通過特有的柱篩選模塊更直觀、便捷的進行柱選擇。其他分離模式的色譜柱，一般可以通過參考廠家給出的案例進行柱選擇。當然，現在很多的色譜柱廠家有自己的技術團隊，為了色譜柱更好的銷售，也提供免費的分析方法開發，分析工作者也可嘗試利用廠家提供的資源來解決問題。

參考文獻：

【1】中國藥典2020年版0512高效液相色譜法

【2】電噴霧檢測器的工作特點及其在藥物分析中的應用進展

【3】現代液相色譜導論