為了微生物檢驗的順利開展，最大限度地避免雜菌污染，需要我們熟練并規范地進行無菌操作，無菌操作是試驗成功的關鍵，必須嚴格遵守操作規程，以確保實驗的順利進行。

 

一、無菌操作技術

 

1、定義　

 

是指在執行實驗過程中，防止一切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區域不被污染的操作技術和管理方法；

 

無菌操作技術是微生物實驗的基本技術，是保證微生物實驗準確和順利完成的重要環節。

 

2、內容

 

無菌操作技術主要包括兩方面：

 

1）創造無菌的培養環境。包括提供密閉的培養容器、培養容器的滅菌、培養基的滅菌等；

 

2）在操作和培養過程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、超凈臺的消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。

 

3、無菌操作原則

 

1）在執行無菌操作時，必須明確物品的無菌區和非無菌區，接種時必須穿工作服、戴工作帽應在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球將手擦干凈；

 

2）在操作前20～30分鐘要先啟動超凈臺和紫外燈，進行接種所用的吸管、平皿及培養基等必須經消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼3次后使用。嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鑷子等；

 

3）從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不能觸及試管或平皿邊；

 

4）接種樣品、轉種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；

 

5）接種環或接種針在接種細菌前應經火焰燒灼全部金屬絲，必須時還要燒到環和針與桿的連接處；

 

6）吸管吸取菌液或樣品時，應用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。傾倒平板應在超凈臺內操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時需反復用酒精燈燒。

 

二、無菌操作的環境要求

 

1、無菌室

 

（1）無菌室的結構：更衣間、緩沖間、操作間；

 

（2）無菌室的消毒和防污染

 

每日（使用前）紫外線照射（0.5~1小時）； 

每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒；

每季度用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時），特殊情況下可增加熏蒸頻次。

（3）無菌室使用要求

 

①無菌室內應保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作臺面，不得存放與實驗無關的物品；

 

②無菌室使用前后應將門關緊，打開紫外線，如采用室內懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕拭擦，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；

 

③處理和接種食品標本時，進入無菌室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。在無菌室內如需要安裝空調時，則應有過濾裝置。

 

2、超凈工作臺

 

超凈臺的使用與保養：

 

（1）風速穩定，且符合要求；

 

（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上；

 

（3）讓超凈臺預工作10－15分鐘；

 

（4）使用完畢后，用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈。

 

3、無菌器材

 

（1）滅菌器材：玻璃器皿、培養基、無菌衣等；

 

（2）消毒器材：無菌室內的凳子、試管架、天平、工作臺、手等。

 

（3）無菌間一般只允許放置無菌操作臺、轉椅等物品；無菌操作臺上一般只允許擺放以下物品： 酒精燈、打火機、接種針、消毒棉球、洗耳球、鑷子、油性筆、滅菌平皿、試管架、滅菌吸管、電子天平、250ml滅菌三角瓶、培養基、均質器等。

 

三、無菌操作的基本技術

 

1、無菌接種操作

 

培養基經高壓滅菌后，用經過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養基上，這個過程叫做無菌接種操作。

在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。

 

 

 

 

1. 接種針灼燒滅菌

進入超凈工作臺前，用75%酒精擦拭雙手，進入超凈工作臺內，待酒精揮發完全，點燃酒精燈，將接種環及金屬棒在火焰上灼燒，將接種環燒至發紅，來回灼燒金屬棒，尤其是接口處。

 

2. 接種針冷卻

 

接種針滅菌后，移到酒精燈旁邊冷卻，備用。

 

3. 接種針接種

配制好固體或液體培養基后，利用高壓蒸汽滅菌鍋進行滅菌，經過滅菌后培養基里無任何微生物，在超過經工作臺內，用接種針等將目標菌種接種到培養基中的過程。

 

劃線分離：

 

由接種環沾取少許待分離的材料，在無菌平板表面進行平行劃線、扇形劃線或其他形式的連續劃線，微生物細胞數量將隨著劃線次數的增加而減少，并逐步分散開來，如果劃線適宜的話，微生物能一一分散，經培養后，可在平板表面得到單菌落。

 

①取菌種：取出目標菌種，融化后，備用；

 

②接種針滅菌：灼燒接種針進行滅菌；

 

③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻；

 

④蘸取菌種：甘油管用75%酒精消毒，待酒精揮發完全，在酒精燈火焰略微滅菌（防止烤糊），然后用接種環蘸取一環菌種；

 

⑤劃線：取已經備好的固體平板，邊轉動平板邊用酒精燈火焰滅菌，打開平板（靠口朝酒精燈），用上述接種環在平板上劃線，先在一側連續劃線3-4次，邊轉動平板邊用酒精燈灼燒接種環，冷卻后，用接種環穿過第一次劃線部分繼續劃線3-4次，同樣方法進行第三次劃線，或第四次劃線（根據菌液濃度和菌種類型確定劃線次數），灼燒接種環；

 

⑥標記：在平板底部邊緣處標記菌種名稱，日期和其他信息；

 

⑦培養：放置于恒溫培養箱中培養；

⑧保存：待培養完成后保存于4℃冰箱，待用。

 

涂布法接種：

先將培養基熔化后趁熱倒入無菌平板中，然后用無菌吸管吸取0.1ml 菌液接種在已凝固的瓊脂平板上。再用無菌L 型玻璃棒將菌液在平板上涂抹均勻，將涂抹好的平板平放于桌上20~30min，使菌液滲透入培養基內，然后將平板倒轉，保溫培養，至長出菌落后即可計數。  

 

斜面接種：

從生長好的平板菌種轉接到新鮮斜面培養基上的接種。主要用于接種純菌，使其增殖后用以鑒定或保存菌種。

 

①取菌種：取出目標菌種平板；

②接種針滅菌：灼燒接種針進行滅菌；

③接種針冷卻：將接種針移至酒精燈旁邊冷卻；

④挑取菌種：在火焰旁打開平板塞子，邊轉動平板邊用酒精燈火焰滅菌，打開平板（靠口朝酒精燈），立即將接種環伸入平板上，挑取單菌落后蓋上平板蓋子，然后左手迅速取出新鮮試管，在火焰旁右手小指取下塞子，并灼燒試管管口，將黏有單菌落的接種環迅速放進新鮮斜面的底部，從下至上Z字劃線，蓋上試管塞，灼燒接種環；

⑤標記：在平板底部邊緣處標記菌種名稱，日期和其他信息；

⑥培養：放置于恒溫培養箱中培養；

⑦保存：待培養完成后保存于4℃冰箱，待用。

 

液體接種：

將接種環送入液體培養基時使環在液體與管壁接觸的地方輕輕磨擦，使菌體分散，塞上試管塞再輕輕搖勻。

 

多用于增菌液進行增菌培養，也可用純培養菌接種液體培養基進行生化試驗，其操作方法與注意事項與斜面接種法基本相同。

 

傾倒法接種：

吸取1ml 菌液加入平板中，倒入已融化并冷卻至45~50℃的細菌培養基，輕輕轉動平板，使菌液與培養基混合均勻，冷疑后倒置，適溫培養。至長出菌落后即可計數。

 

螺旋接種法：

可以在無任何全部或中間稀釋的情況下快速細菌接種。對數減少的樣品容量以阿基米德螺旋線的形式被自動分注在旋轉式培養基表面。培養基上每一點的容量可以被知曉和校準。菌液的濃度可以通過培養皿上一定區域的菌落數量除以同區域樣品分注量來計算。  

 

四、微生物檢驗過程中的注意事項

 

（1）在操作中不應有大幅度或快速的動作；

（2）使用玻璃器皿應輕取輕放；

（3）在正火焰上方操作；

（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；

（5）在接種培養物時，協作應輕、準；

（6）不能用嘴直接吸吹吸管；

（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內消毒。

文章來源：《食品微生物檢測實驗技術》周紅麗等主編 中國標準出版社出版；