生物材料的選擇是組織工程和再生醫學應用發展中必不可少的一步。來源于細胞外基質(ECM)的生物材料具有允許生理上重現幾個過程的特性，這些過程導致內環境平衡組織或器官功能的重建。本文綜述了用于分離和加工ECM衍生生物材料的主要策略，以及用于表征其特性的不同技術。最后，對它們在術語領域的一些應用進行了探索和討論。

 

1. 引言

 

組織工程和再生醫學(TERM)是一個跨學科的領域，旨在找到修復或再生受損組織和器官的解決方案。為了實現這樣的解決方案，通常需要一種ECM替代物，例如支架，并且使用來自天然或合成來源的生物材料來獲得所述替代物。理想的生物材料應該結合了合成材料和自然材料的最佳特性，為了實現更高的再生/修復潛力，生物材料應該為細胞提供良好的微環境。考慮到這一點，在過去的幾年里，一組特殊的生物材料引起了更大的興趣：細胞外基質(ECM)衍生的生物材料。ECM是一個復雜的細胞產生的3D網絡，它將細胞嵌入全身的組織和器官中，支持它們的功能和生存。

 

本文的目的是綜述制備細胞外基質衍生生物材料的主要方法，從不同的來源(器官/組織或細胞培養)，到不同的脫細胞過程(，表征類型(生化、化學、物理、形態和生物)，最后是在該術語領域的特定應用(水凝膠、生物印刷和靜電紡絲)(圖1)。

 

 

2. 細胞外基質成分與細胞功能的調節

 

細胞外基質是由體內不同組織內的細胞產生的有組織的3D網絡，由幾個大分子組成，其最終組成因組織而異。。ECM是一個高度動態的結構，在生理和病理條件下(如癌癥)，它會被多次翻譯后修飾和重塑而不斷改變。根據ECM的作用，這些蛋白質可以分為兩類，即結構蛋白(纖維蛋白)和非結構蛋白(蛋白多糖和糖蛋白)。細胞外基質的其他基本成分包括生長因子(GFS)、整合素和各種基質金屬蛋白酶(MMPs) (圖2)。

 

 

2.1 膠原蛋白

 

膠原蛋白是ECM中最豐富的纖維蛋白。事實上，它是人體結締組織(如肌腱和皮膚)中最豐富的蛋白質，大約有30個已確定的亞型。該分子參與多種機制，如旁分泌調節細胞行為，促進粘附、增殖和分化。

 

2.2 彈性蛋白

 

彈性蛋白是另一種主要的細胞外基質纖維，由原彈性蛋白亞基與一層纖維蛋白微原纖維交聯而成，后者構成彈性纖維。這一特性允許富含彈性蛋白的組織具有彈性，并允許它們在受到反復拉伸時恢復/回彈。彈性蛋白作為生物材料被廣泛應用于組織工程。

 

2.3 纖維連接蛋白

 

纖維連接蛋白表達在多種細胞類型的基膜上，這些細胞在脊椎動物發育過程中具有必要的功能。纖維連接蛋白和整合素之間的相互作用是最佳細胞外基質形成的基礎，而細胞黏附和遷移又需要細胞外基質，影響無數的過程。纖維連接蛋白也與心血管疾病和腫瘤進展有關。

 

2.4 層粘連蛋白家族

 

層粘連蛋白家族由基底膜中的多結構域、異三聚體糖蛋白組成，與其他細胞外基質成分交聯。這些三聚體亞型中的每一種都由3條鏈(α，β和γ)組成，根據它們的細胞和組織特異性，它們以不同的遺傳形式存在。這些蛋白質與血管生成有關，有助于血管的生長和成熟。

 

2.5糖胺多聚糖

 

糖胺多聚糖(GAG)是一組由二糖重復單元組成的線性多糖。由于其顯著的結構多樣性，GAG具有與廣泛的生物分子相互作用的能力。這些相互作用在各種生物過程中起著關鍵作用，包括細胞遷移、分裂、血管生成和膠原纖維形成。此外，GAG在治療血栓、新生血管、癌癥和炎癥等病理疾病方面顯示出治療潛力，使其非常適合治療應用。

 

2.6腱生蛋白

 

腱生蛋白是ECM糖蛋白的一個多功能基團，其中腱生蛋白-C是最早被描述和研究最好的。腱生蛋白家族的其他成員包括腱生蛋白-R、-W、-X和-Y。腱生蛋白具有獨特的模塊結構，由不同數量的重復結構域組成的相同亞基組成，其中包括七肽重復序列、一系列纖維連接蛋白III型結構域、表皮生長因子樣重復序列和C-末端球狀結構域。

 

2.7 其他成分包括整合素，生長因子，基質金屬蛋白酶

 

3. 細胞外基質的分離和脫細胞

 

3.1來自組織/器官

 

如前所述，功能組織修復領域術語的方法之一集中在使用由生物材料制成的支架。這些生物材料可歸類為合成材料或從生物來源收集的自然材料。ECM衍生的生物材料是天然來源的生物材料的一個例子。這些材料可以包括完整的細胞外基質提取物或純化的細胞外基質成分，如I型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白或透明質酸。合成的材料可以作為模板，為功能性組織修復提供重要的信號分子。圖3描述了物理和化學脫細胞過程對分離的ECM的機械和物理化學性能的影響的比較。圖4展示了組織脫細胞及其形態和物理化學特征的例子。

 

3.2 來自細胞培養

 

從人或動物來源的脫細胞組織中分離出的細胞外基質是臨床上最成功的生物材料之一。然而，它也存在一些限制，比如它的可用性有限。細胞培養來源的細胞外基質(CC-ECM)能夠克服組織來源的細胞外基質所帶來的諸多限制，并具有能夠在很大程度上重現天然組織復雜生物系統的特性。因此，CC-ECM支架在長期應用中取得了顯著的效。

 

4. ECM表征方法

 

如前所述，感興趣的材料(組織/器官或細胞培養)的脫細胞過程不可避免地會對提取的細胞外基質造成變化。因此，有必要評估加工步驟對最終產品的成分和生物性能的影響。要做到這一點，通常會進行幾種方法分析。通過比色分析、SDS-PAGE、Western Blot、免疫組織化學、蛋白質組學、FTIR和拉曼光譜以及圓二色譜對提取的細胞外基質的化學組成、生化組成和結構特征進行了評價。ECM的物理性能也可以通過流變學進行測定，而其熱穩定性則通過差示掃描量熱法進行評價。此外，可以通過掃描和透射電子顯微鏡以及原子力顯微鏡等幾種顯微技術對所得到的材料進行超微結構評估(形態)。最后，在體外和體內實驗中對ECM衍生的構建物進行了功能生物學表征。

 

圖5提供了一個流程圖，以幫助研究人員使用脫細胞ECM選擇最合適的表征技術，以評估不同的特征。

4.1化學、生化和結構表征

 

4.1.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western 免疫印跡

 

為了評估脫細胞處理后的成分，通常使用SDSPAGE(十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法)比較ECM提取物中的蛋白質圖譜。SDS-PAGE是一種通過在多孔凝膠中使用電流來根據蛋白質的相對分子質量分離蛋白質的技術。

 

4.1.2比色法

 

基于染料標記技術的定量方法是測定ECM組分的最常用的方法之一。可以快速、可靠、經濟和靈敏地對主要元素，如膠原(總的、不溶的或可溶的)、彈性蛋白和GAG進行定量分析。比色分析以快速的程序提供了有價值的信息。從作者的觀點來看，比色分析提供了對從SDS-PAGE和Western Blot獲得的數據的極好補充。

 

4.1.3 組織學

 

細胞外基質組織學分析是一種定性方法來評估細胞外基質單個蛋白，并確定它們的存在和定位。要通過組織學分析組織樣本，樣本通常需要在樹脂、OCT或石蠟中包埋，并在染色前切成薄片。圖7可以看到蘇木精-伊紅，天狼星紅等指標。

 

4.1.4傅里葉變換紅外光譜和拉曼光譜

 

傅里葉變換紅外光譜(FTIR)和拉曼光譜是用于化學和結構鑒定的最重要的振動光譜技術，它們相輔相成。拉曼光譜依賴于光和分子相互作用產生的非彈性光散射(拉曼效應)，從而能夠識別非極性基團。

 

4.1.5 質譜法

 

質譜學是迄今為止關于ECM表征的最完整的技術。它允許鑒定和定量樣品中的所有蛋白質，具有顯著的重復性和靈敏度。ECM的廣泛應用推動了關于這一主題的大量報告。

 

4.1.6圓二色譜

 

圓二色譜(CD)是一種光吸收光譜方法，它可以研究蛋白質的二級結構、它們與其他分子的相互作用、折疊、穩定性和配體結合性質。這種方法是基于光學活性分子對(左手和右手)圓偏振光吸收的差異來確定它們的分子構型。

 

4.2 物理表征

 

4.2.1差示掃描量熱法

 

差示掃描量熱法(DSC)是一種熱分析方法，用于測量生物分子(如天然蛋白質)的穩定性。DSC測量與溫度變化引起的轉變相關的熱交換，這與蛋白質的熱變性或“熱熔化”有關。在蛋白質的情況下，DSC可以用作配體結合的指示器，以評估熱力學穩定性及其折疊機制。

 

4.2.2 流變學

 

流變學是研究材料在外加應力或力作用下的流動和變形的科學。它側重于了解材料如何響應不同類型的機械力，以及它們的物理屬性如何影響它們的流動行為。流變學評估的最重要的性質之一是粘彈性。彈性是材料在變形后恢復其原始形狀的能力，而粘度是流動和耗散能量的能力。ECM同時表現出彈性和粘性特征。ECM另一個需要評估的重要流變性是硬度或剛性，它會影響細胞行為和組織功能。

 

4.3 形態表征

 

細胞外基質和細胞外基質衍生支架的超微結構也是它們在生命系統中性能的決定因素。因此，有關細胞外基質超微結構及其與周圍微環境相互作用的高分辨率信息是非常重要的。因此，一些成像技術被用來研究ECM和ECM衍生支架的形態和拓撲特征，包括掃描和透射電子顯微鏡(SEM和TEM)和原子力顯微鏡(AFM)。

 

4.3.1 掃描電子顯微鏡

 

掃描電子顯微鏡(SEM)是一種強大的工具，它可以通過聚焦的電子束掃描樣品的表面來創建3D圖像。它提供納米級的高分辨率圖像，放大倍數可達2×105倍。可以獲得有關樣品的表面形貌、形態和成分的詳細信息。圖10顯示了人類沃頓凝膠體脫細胞后細胞外基質纖維狀結構的維持。

 

4.4 生物學特性

 

4.4.1 體外和體內試驗

 

細胞外基質及其衍生支架的最終表征是評估其與生物系統相互作用時的功能性、生物相容性和再生潛力。為此，需要進行體外和/或體內測試。

 

5. ECM派生組件的術語應用

 

用于長期應用的ECM衍生生物材料無論是作為單獨的ECM組件還是與其他生物材料集成在一起，都得到了越來越多的探索。一般來說，在設計支架時，幾個關鍵的考慮因素是重要的：生物兼容性、生物降解性、機械性能、支架結構和制造技術。在這一部分中，我們將概述使用不同技術從ECM衍生生物材料中設計的常用支架，即水凝膠、生物打印支架和電紡支架。

 

5.1 水凝膠

 

在所研究的幾種用于長期應用的ECM支架類型中，水凝膠是迄今為止研究最多的。水凝膠被定義為高度水合的3D網絡，由于聚合物/蛋白質鏈之間的化學或物理網狀結構，它保持了結構的完整性。這種高度水合的3D結構使水凝膠能夠保留大量的水。水凝膠還具有其他優點，如改善的生物相容性、生物識別性和生物降解性，而不會產生毒性。

 

5.2 3D生物打印支架

 

3D生物打印是一項多用途技術，通過使用計算機設計的模型和生物墨水有效地創建具有精確和復雜結構的組織結構。這項技術使用生物墨水中生物成分的逐層精確定位，允許控制多種支架特征，如結構、成分、孔徑和表面化學。眾所周知，含有脫細胞ECM的生物墨水比含有其他天然聚合物的墨水具有更好的再生能力，因為它們保留了許多先前描述的組織特有的天然特征。事實上，脫細胞ECM已經被用作幾種生物醫學應用的生物墨水。

 

5.3 電紡技術

 

近年來，電紡技術已被用于制備具有取向多絲納米纖維的ECM衍生支架，其結構類似于自然環境中ECM的納米纖維骨架。這些支架提供了具有相互連接的毛孔的納米級纖維結構，類似于天然的ECM，展示了創建功能組織的良好潛力。圖11描述了這里描述的ECM的三個術語應用的例子。

 

 

6. 總結

 

本文概述了細胞外基質衍生生物材料在術語領域中的應用，從分離到應用階段，重點介紹了表征部分。要充分實現這些材料的臨床潛力，仍然存在幾個挑戰。

 

脫細胞技術是獲得ECM衍生生物材料的關鍵步驟，是復雜和具有挑戰性的。在保持ECM所需性能的同時，實現細胞的完全去除是深入研究的目標。驗證脫細胞方案的努力的一個重要部分是選擇適當的表征技術。雖然實際上有一大套可用的技術，但對ECM的完整描述是非常耗時和資源的。ECM基生物材料的一個共同特征是衍生支架的機械性能相對較弱，這在術語應用的上下文中可能被認為是有限的。

 

雖然上述所有問題都是重要的障礙，但正在進行的研究表明，這些問題將在中短期內由社區解決。對基于ECM衍生生物材料的產品進行更全面的臨床前和臨床測試將帶來新的挑戰。

 

原文信息

 

The title of the article is “Extracellular matrix-derived materials for tissue engineering and regenerative medicine: A journey from isolation to characterization and application”

 

DOI: 10.1016/j.bioactmat.2024.01.004