分析方法的質(zhì)量是藥品質(zhì)量控制中的重要研究內(nèi)容，開發(fā)穩(wěn)健可靠的分析方法是藥品研發(fā)人員的關(guān) 鍵目標(biāo)之一。各國藥典及國際組織均先后頒布了有 關(guān)分析方法的指導(dǎo)原則，這些指導(dǎo)原則涵蓋了分析方法生命周期的各部分，包括方法開發(fā)、驗(yàn)證、確認(rèn)、轉(zhuǎn)移等。
判斷分析方法是否能滿足其預(yù)期用途，是方法驗(yàn)證所要探討的核心問題之一，在 2015 版和 2020 年 版《中華人民共和國藥典》(以下簡稱《中國藥典》) 中增加了對此問題的解決思路，即采用 Horwitz 方程作為接受標(biāo)準(zhǔn) 。 然而，被國內(nèi)廣泛接受并使用的 Horwitz 方程具有一定局限性，且 USP 也已經(jīng)放棄使用該方程作為方法性能的判斷標(biāo)準(zhǔn)。
本文在簡要概述 Horwitz 方程內(nèi)容的基礎(chǔ)上，探討了使用 Horwitz 方程作為判斷方法滿足預(yù)期用途的不足之處，并介紹最新研究的可行方式，以用于替代 Horwitz方程在方法驗(yàn)證接受標(biāo)準(zhǔn)中的作用。
1、 Horwitz 方程概述
1980 年，Horwitz 等對1000 多個(gè)實(shí)驗(yàn)室間的 實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行了比較研究，發(fā)現(xiàn)方法的重現(xiàn)性相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)和分析物的濃度水平之間的關(guān)系，可 以用如下公式表示:
公式中 RSD 為實(shí)驗(yàn)室間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，即方法重現(xiàn)性 RSD，c 為分析物的質(zhì)量或濃度分?jǐn)?shù)(例如被分析物濃度為 1 mg•g-1 時(shí)，c=10-3)。
Horwitz方程在發(fā)現(xiàn)之初是作為重現(xiàn)性RSD的經(jīng)驗(yàn)描述，它關(guān)注的是方法在不同實(shí)驗(yàn)室使用過程中的精密度。同時(shí)還衍生出了 Horrat 值以用于評估實(shí) 驗(yàn)室間比較的質(zhì)量，該值給出了分析物的特定水平下測量方法的實(shí)際測量精密度與 Horwitz 方程的預(yù)測值的比較，公式如下[3]:
通常來說，Horrat 值越小表示實(shí)驗(yàn)室間的精密度越讓人滿意，當(dāng) Horrat 值大于 2 時(shí)，則認(rèn)為該分析方法的變異太大或者說大于根據(jù) Horwitz 方程 計(jì)算的預(yù)期變異，因此一般建議將 Horrat 值設(shè)定在 0.5~2.0之間作為可接受標(biāo)準(zhǔn)。據(jù)此，在為方法性能提供可接受標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，期望實(shí)驗(yàn)室間的方法變異值在 Horwitz方程所計(jì)算RSD的0.5~2倍之間。
Horwitz 方程提出后，逐漸得到認(rèn)可，并被部分法規(guī)所采納。其中最主要的是 ISO13258，它將 Horwitz 方程預(yù)測值作為實(shí)驗(yàn)室分析能力的判斷標(biāo)準(zhǔn)[5]。此外，《中國藥典》2020 年版將 Horwitz 方程作為方法驗(yàn)證中準(zhǔn)確度和精密度的可接受標(biāo)準(zhǔn); 甚至有人建議使用 Horwitz 方程的結(jié)果作為測量 確定性的估計(jì)，Horwitz方程的應(yīng)用范圍被逐漸擴(kuò)大。
然而，根據(jù)下面第 2 部分的分析，作者建議分析人員可以使用 Horwitz 方程來對方法歷史數(shù)據(jù)進(jìn)行總結(jié)評估，但不應(yīng)將其用作方法驗(yàn)證的可接受標(biāo)準(zhǔn)，或者使用此代替對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不確定性進(jìn)行估計(jì)。
2、 Horwitz 方程的局限性探討
2.1 未包含所有變異來源
Horwitz 在后期對更多數(shù)據(jù)集進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)果與 Horwitz 方程的預(yù)測值相差很大。并且在 Horwitz 的原始論文和一些后續(xù)論文中，雖然證明了分析物的濃度水平是解釋實(shí)驗(yàn)室間方法重現(xiàn)性的最重要變量，但從未論述過此方程的計(jì)算結(jié)果涵蓋了所有方法變異，即 Horwitz 方程的預(yù)測值不能包含所有的方法影響來源(見本部分第 3 條)，而這正是 Horwitz 方程不能作為方法驗(yàn) 證接受標(biāo)準(zhǔn)的原因之一。
Linsinger 等人針對 Horwitz 論文中有關(guān)真菌毒素測定的數(shù)據(jù)，進(jìn)行了重新分析，建立了濃度與重現(xiàn)性 RSD 的回歸方程，并將此方程與 Horwitz 方程進(jìn)行比較研究。結(jié)果顯示，Horwitz 方程完全落在了回歸方程的 95% 置信區(qū)間之外，并且回歸方程的決定系數(shù) R2 為 0.22，這表明 Horwitz 方程能解釋的 RSD 只有 22%。因此盡管濃度肯定會影響重現(xiàn)性，但幾乎 80% 的重現(xiàn)性無法用 Horwitz 方程解釋。
另一項(xiàng)針對膳食纖維方法的驗(yàn)證數(shù)據(jù)回顧性研究也表明:Horwitz 方程不能有效預(yù)測其研究 結(jié)果。在研究的 391 項(xiàng)分析數(shù)據(jù)中，只有 16% 的 Horrat 值低于 2，這意味著如果將 Horrat 值作為可接受標(biāo)準(zhǔn)，那么將有 84% 的結(jié)果會被拒絕。
此外，Horwitz 對此方程的優(yōu)勢和局限性一直持有開放性態(tài)度，承認(rèn)了 Horwitz 曲線并非普遍適用于所有分析物。對于某些種類的化合物，例如水分和灰分的測定等，Horwitz 方程均不適用。上述文獻(xiàn)說明，在針對具體檢測項(xiàng)目時(shí)，Horwitz 方程有明顯不足。因此將 Horwitz 方程作為判斷方法是否滿足其“預(yù)期用途”的通用標(biāo)準(zhǔn)或依據(jù)，具有很大風(fēng)險(xiǎn)。
2.2 缺少不確定度
如果僅僅根據(jù) Horwitz 方程， 計(jì)算得到的是確定的 RSD 單值，但實(shí)際上根據(jù)文獻(xiàn)中的回歸方程，RSD 具有不確定性，Linsinger TP 等人建議納入預(yù)測區(qū)間以確定 RSD 的范圍。而 Horwitz 方程恰恰忽略了方法性能評估中的不確定度。
使用 Horwitz 方程的預(yù)測結(jié)果計(jì)算測量不確定度的做法，也與 ISO所要求的測量不確定度評估方法相矛盾。不確定度計(jì)算的基本思想是收集有關(guān)特定 測量的信息，并在理想情況下評估所有不確定因素的貢獻(xiàn)。當(dāng)從方法驗(yàn)證數(shù)據(jù)中計(jì)算了變異度后，應(yīng)使用一些常規(guī)的質(zhì)量保證工具(如質(zhì)量控制圖)將實(shí)際測量結(jié)果與方法性能標(biāo)準(zhǔn)聯(lián)系起來。但使用 Horwitz 方程結(jié)果作為 RSD 的評估標(biāo)準(zhǔn)，切斷了實(shí)際測量值和不確定度估值之間的關(guān)系，這意味著 Horwitz 方程的結(jié)果很可能不是測量不確定度的準(zhǔn)確估值。
2.3 未聯(lián)系產(chǎn)品限度范圍
如果僅以 Horwitz 方程得出的計(jì)算結(jié)果作為方法是否能滿足預(yù)期用途的依 據(jù)，而未與產(chǎn)品或檢測項(xiàng)目的限度范圍相聯(lián)系，可能會導(dǎo)致如下后果:
(1)如果所檢測產(chǎn)品(檢測項(xiàng)目)根據(jù)其安全性 、有效性 ，制定了較為寬泛 的限度范圍 ，那么使用 Horwitz 方程的標(biāo)準(zhǔn)來評價(jià)方法是否滿足預(yù)期用途， 會把一些不滿足 Horwitz 方程標(biāo)準(zhǔn)，卻仍可以保證產(chǎn)品準(zhǔn)確檢測的方法排除在外。這種情況，會對企業(yè)建立方法產(chǎn)生過多要求。例如，當(dāng)某分析物在產(chǎn)品中的可接受上限是 100 μg·mL-1，根據(jù) Horwitz 方程， 預(yù)測其在該濃度水平下的重現(xiàn)性 RSD 為 8%，即由檢測方法導(dǎo)致的測定誤差范圍為 ±8 μg·mL-1。但若產(chǎn)品中該分析物的實(shí)際濃度水平在 10 μg·mL-1，此時(shí)根據(jù) Horwitz 方程的預(yù)測結(jié)果，方法重現(xiàn)性 RSD 應(yīng)為 11%，即由檢測方法導(dǎo)致的測定誤差范圍為 ±1.1 μg·mL-1[11]。然而，由于 10 μg·mL-1 的濃度水平遠(yuǎn)低于確定的標(biāo)準(zhǔn)上限，指定如此高的精密度(±1.1 μg·mL-1)是沒有必要的，不但會浪費(fèi)更多的資源，而且對產(chǎn)品的質(zhì)量控制過程也不能帶來更高的益處。
(2)如果所檢測產(chǎn)品(檢測項(xiàng)目)根據(jù)其安全性、有效性，必須限定在較窄的限度范圍，那么，這時(shí)使用 Horwitz 方程會指定過低的方法精密度和準(zhǔn)確 度，從而無法保證產(chǎn)品的安全性或有效性。例如，《中國藥典》對于原料藥的含量測定，常見的限度范圍是 標(biāo)示量的 98% 以上，根據(jù) Horwitz 方程，準(zhǔn)確度(回 收率)在 98%~101%，重現(xiàn)性 RSD 值在 2% 內(nèi)時(shí)，認(rèn)為方法滿足需求。這種寬泛的標(biāo)準(zhǔn)，使預(yù)期的方法變異已達(dá)到質(zhì)量限度范圍所允許的最大變異，而沒有給產(chǎn)品的其他變異，如工藝波動(dòng)、穩(wěn)定性變化等留出余 地。若按照此標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制，則這種方法的準(zhǔn)確度和 精密度可能會導(dǎo)致產(chǎn)品不合格(OOS)的概率增大， 不利于產(chǎn)品的質(zhì)量控制。若該方法是檢測一個(gè)毒性很強(qiáng)的成分(現(xiàn)實(shí)需要規(guī)定更窄的限度范圍)，將導(dǎo)致嚴(yán)重的臨床后果。
2.4 其他關(guān)鍵因素的忽略
根據(jù) Horwitz 方程，方法的重現(xiàn)性 RSD 僅考慮了分析物的濃度，而忽視了分析物的種類、分析方法等因素的影響，舉例如下:
(1)忽略了不同的產(chǎn)品或檢測項(xiàng)目，其重現(xiàn)性 RSD 不同。Horwitz 本人曾討論過分析物的影響，并 得出結(jié)論:與其他測定相比，霉菌毒素測定的重現(xiàn)性 較差。還有從廣泛的觀察結(jié)果發(fā)現(xiàn)，分析物的種類會 影響測量方法的重現(xiàn)性，在痕量金屬中表現(xiàn)的尤其明顯。
(2)忽略了同一產(chǎn)品屬性的不同分析方法也會 影響到分析方法的重現(xiàn)性。顯然，基于液相色譜的分 析方法往往比薄層色譜法具有更好的可重現(xiàn)性;操 作的復(fù)雜與否也會影響方法的精密度，簡單的重量分 析例如干燥后的殘留物測定，往往比涉及到復(fù)雜化學(xué) 操作的方法精密度更好。相信隨著分析設(shè)備和分析方法的不斷發(fā)展，方法的精密度將不斷得到改善。
3、 討論
分析方法是藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)鍵要素，是保證檢 測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的根本。而選擇更加科學(xué)準(zhǔn)確的反 映方法滿足預(yù)期用途的標(biāo)準(zhǔn)是方法驗(yàn)證中必須回答 的問題。早期的方法驗(yàn)證文件，如 ICH Q2(R1)，因當(dāng)時(shí)的研究不充分，未給出相應(yīng)的判定標(biāo)準(zhǔn)，亦有法規(guī) 進(jìn)行了相應(yīng)探討。雖然有法規(guī)將 Horwitz 方程作為 理化方法驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)，但在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)其存在明 顯缺陷[14]。歐洲官方實(shí)驗(yàn)室(OMCL)也進(jìn)行了相應(yīng) 探討，并從方法精密度的角度提出了判斷標(biāo)準(zhǔn)[15]，然 而該標(biāo)準(zhǔn)忽略了方法的準(zhǔn)確度，也不夠全面。作者認(rèn)為下面2種方式更適于作為方法驗(yàn)證的判定標(biāo)準(zhǔn)。
3.1 容忍區(qū)間和預(yù)測區(qū)間滿足預(yù)期用途的預(yù)判標(biāo)準(zhǔn)
該方式最早收載于 2018 年 USP 41-NF 36 中新 增的 <1210>，在 <1210> 中，對于定量類分析方 法，使用方法準(zhǔn)確度 - 精密度聯(lián)合評價(jià)的方式得到 方法檢測結(jié)果的容忍區(qū)間和預(yù)測區(qū)間，將其作為方法 驗(yàn)證應(yīng)提供的參數(shù)以評價(jià)其是否滿足質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的要 求。該方式的思路是:建立新方法 - 方法驗(yàn)證找出 方法變異的范圍 - 確定產(chǎn)品檢測時(shí)的限度范圍。但 對統(tǒng)計(jì)基礎(chǔ)薄弱的藥品專業(yè)人員而言，該方式具有(1)計(jì)算相對復(fù)雜;(2)比較抽象;(3)不知如何與已 有限度標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品直接關(guān)聯(lián)評價(jià)，即，不知如何判定 該新建方法是否已經(jīng)滿足對現(xiàn)有產(chǎn)品的檢測的預(yù)期用途等缺點(diǎn)。
3.2 方法能力指數(shù)
FDA 在 2015 版的方法驗(yàn)證指 南 中已經(jīng)提到在評價(jià)方法性能參數(shù)如準(zhǔn)確度和精 密度時(shí)，需要考慮到其具體用途，對于生產(chǎn)工藝中的 原料藥和成品等，其樣品要求是不同的。顯然，對于質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)里限度范圍不同的產(chǎn)品，其所允許的方法變 異范圍存在差異。2019 年，譚德講等從已有產(chǎn)品 質(zhì)量限度標(biāo)準(zhǔn)或預(yù)定期產(chǎn)品質(zhì)量限度范圍的角度出 發(fā)，提出了使用方法能力指數(shù)的概念，將產(chǎn)品質(zhì)量中 的限度范圍標(biāo)準(zhǔn)與方法總變異結(jié)合的方式對方法進(jìn) 行判斷。該方式還提出了檢測方法的可靠性分級及 具體使用時(shí)產(chǎn)生方法誤判概率的計(jì)算，使檢測人員更易于理解。作者認(rèn)為，方法驗(yàn)證中，通過提供上述 2 種方式的評價(jià)參數(shù)，可以更科學(xué)、全面地說明該方法對檢測產(chǎn)品是否滿足檢測需求。
