由于口腔環境復雜，如潮濕、細菌和動態力學等，口腔傷口治療面臨挑戰，因此，快速密封傷口成為十分必要的需求。雖然一些材料已經實現了粘附和抗菌功能，但如何有效解決強粘附和按需清除之間的矛盾仍是一個難題。
來自四川大學的Weifeng Zhao和趙長生團隊通過陽離子單體[2-（丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化銨（ATAC）、疏水性單體乙二醇苯醚丙烯酸酯（PEA）和 N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm）的自由基共聚，設計了一種可逆粘附性水凝膠。陽離子季銨鹽起靜電作用，疏水基團起疏水作用，PNIPAAm 鏈段起氫鍵作用，從而產生強大的粘附力。此外，與純 PNIPAAm 不同的是，由于 ATAC 和 PEA 的作用，該水凝膠的 LCST 為 40.3 ℃，因此處理后可以用 40 ℃ 的水快速去除。此外，該水凝膠還具有出色的消腫率（80%∼）和抗菌效率（90% 以上）。動物實驗證明，水凝膠能有效減少炎癥浸潤，促進膠原蛋白沉積和血管再生。因此，水凝膠作為一種多功能敷料在口腔傷口處理方面具有廣闊的應用前景。相關工作以題為“Reversibly Adhesive, Anti-Swelling and Antibacterial Hydrogels for Tooth-Extraction Wound Healing”的文章發表在2024年02月14日的國際頂級期刊《Advanced Healthcare Materials》。
1. 創新型研究內容
本研究開發了一種兼具消腫和抗菌特性的多功能水凝膠粘合劑，它能以可逆粘合的方式快速封閉傷口，可作為治療拔牙窩的專用敷料。如圖 1a 所示，水凝膠 PAPN 是由陽離子單體[2（丙烯酰氧基）乙基]三甲基氯化銨（ATAC）、疏水性乙二醇苯醚丙烯酸酯（PEA）和 N-異丙基丙烯酰胺（NIPAAm）通過自由基共聚，然后進行溶劑交換制備而成。陽離子季銨鹽不僅能殺菌，還能通過靜電作用提供粘附力；疏水基團提供疏水粘附力，增強相鄰陽離子基團的靜電作用，限制水凝膠的膨脹；聚（N-異丙基丙烯酰胺）（PNIPAAm）鏈段通過調節氫鍵實現溫度可調的可逆粘附。PAPN 水凝膠顯著的抗溶脹特性可使其在口腔治療過程中保持穩定的機械和粘附性能。此外，PAPN 的按需脫落特性使其可以用溫水無痛去除，避免了因更換敷料而造成的二次傷害。本研究還驗證了水凝膠的溫度響應，并探索了可逆粘附的機理。體外實驗證明了水凝膠的抗菌特性和細胞相容性。此外，本研究還進行了動物實驗，以驗證水凝膠在傷口密封和組織愈合方面的性能。
【水凝膠的制備和表征】
本研究通過自由基共聚合成了 PAPN 水凝膠，合成過程如圖 1a 所示。以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，用 ATAC、PEA 和 NIPAAm 三種單體制備水凝膠，并通過紫外線交聯，然后用水進行溶劑交換。此外，只用 ATAC 制備的水凝膠被命名為 PA，而 PAP 水凝膠是用 ATAC 和 PEA 單體制備的。如圖 1b所示，在與水交換溶劑后，PA 水凝膠的尺寸明顯增大。這可能是由于季銨鹽的親水性和水凝膠網絡的多孔性促進了 PA 水凝膠的溶脹。對于 PAP 和 PAPN 水凝膠來說，水是一種劣質溶劑。因此，在替換了良好的溶劑二甲基亞砜后，分子鏈會從拉伸變為團聚，水凝膠的體積也會縮小，凝膠的顏色也會從透明變為半透明。圖 1c 顯示了 PA、PAP 和 PAPN 水凝膠的傅立葉變換紅外光譜。所有水凝膠都在 951 cm-1 處有 -CH2-N+(CH3)3 吸收峰，在 1731 cm-1 處有 C=O 羰基峰。此外，PAP 和 PAPN 水凝膠都在 1599 cm-1 處含有苯環骨架振動， 而 1648 cm-1 處的酰胺羰基峰只在 PAPN 凝膠中觀察到。根據拉曼光譜（圖 1d），三種水凝膠樣品都含有 2930 cm-1 處的 -CH3 對稱振動峰。在引入苯環后，PAP 和 PAPN 中觀察到了單取代苯環的 995 cm-1 處的 C-C 對稱振動和 1027 cm-1 處的 C-H 振動。
圖1 PAPN 水凝膠制備過程示意圖
【水凝膠的粘附性能】
濕潤條件下穩定而強大的粘附力對于在牙槽窩拔牙創中應用凝膠至關重要。本研究通過測量水凝膠脫離基底表面所需的力來確定粘附強度（圖 2a）。與 PAP 凝膠相比，PAPN 凝膠在 25 ℃ 時與玻璃的粘附強度和粘附能量更高，分別為 50.4 kPa 和 25.56 J m-2（圖 2b）。PAPN 的粘附性能可歸因于三個方面：PEA 與基質之間的疏水作用、季銨鹽與基質表面之間的靜電作用以及 PNIPAAm 與基質之間的氫鍵作用。此外，反復粘附測試表明，PAPN 水凝膠在經過 60 次粘附-脫粘循環后仍能保持原有的強大水下粘附力（圖 2c）。圖 2d 表明，直徑為 25 毫米、厚度為 1.0 毫米的 PAPN 水凝膠可在水中快速粘附 500 克重物 10 秒鐘，然后將其從水中提升到空氣中。
圖2 粘附試驗示意圖以及水凝膠在水中（25 ℃）與玻璃基底的粘附強度
【PAPN水凝膠的可逆粘附機制】
眾所周知，PNIPAAm 是一種典型的熱收縮聚合物，在 32 ℃ 左右會發生親水-疏水轉變，導致體積突變。差示掃描量熱儀（DSC）證實，PAPN 水凝膠在水和 NaCl 溶液中的 LCST 分別為 40.3 ℃ 和 29.6 ℃（圖 3a）。當溫度從 25 ℃ 升高到 45 ℃ 時，PAPN 水凝膠與水和 NaCl 溶液的接觸角增加了 10° 以上（圖 3b），這表明當溫度超過 LCST 時水凝膠的疏水性增加了。為了進一步探討可逆粘附機理，本研究使用傅立葉變換紅外光譜結合廣義二維相關光譜（2DCS）在 25-45 ℃下詳細分析了 PAPN 中的氫鍵相互作用。通過合并 3000-2830 cm-1 的同步和非同步光譜，可以確定基團的響應順序（2DCS 中的紅色和藍色區域代表正交叉峰和負交叉峰）。根據野田定律（Noda’s rule），對于兩個給定的吸收峰，如果同步光譜和異步光譜的符號相同，則文波數較大的吸收峰會先發生變化；相反，如果符號相反，則文波數較小的吸收峰會先發生變化。從圖 3c 和 d 中可以看出，（2961，2923）cm-1 在同步圖中有一個正交叉峰，而在異步圖中有一個負交叉峰。推斷加熱過程中 2923 cm-1 波段的強度先于 2961 cm-1 波段發生變化。這表明在加熱過程中，PAPN 水凝膠首先沿著主鏈塌縮聚集，然后在側鏈上脫水，水分子從水凝膠網絡中排出。
圖3 PAPN 凝膠在水和 0.7 mol L-1 NaCl 溶液中的 LCST以及不同溫度下水凝膠與水和 0.7 mol L-1 NaCl 溶液的接觸角。
【水凝膠的抗膨脹和機械性能】
為了評估水凝膠在真實口腔條件下的實際性能，本研究將水凝膠浸泡在人工唾液中測試其溶脹率。圖 4a 顯示 PA 水凝膠的溶脹率最大，約為 611%。相比之下，PAP 和 PAPN 水凝膠的膨脹率明顯下降，幾乎只有 PA 水凝膠的八分之一。其中，PAPN 凝膠的膨脹率僅為 80% 左右。為了更好地量化水凝膠在溶脹過程中的面積變化，本研究計算了 PAPN 水凝膠在第 0、1、3 和 5 天的平均溶脹面積，結果顯示幾乎沒有差異（圖 4b）。低膨脹率表明 PAPN 水凝膠能更好地適應復雜的口腔環境，保持形態和機械性能的穩定，并能長期牢固地粘附在拔牙窩的創面上。此外，PAPN 水凝膠在降解 3 天后顯示出較低的降解率（6.2%）。這些結果表明，PAPN 水凝膠在復雜的口腔環境中具有廣闊的應用前景。圖 4c 中的熱重分析（TGA）曲線顯示，三種水凝膠都在 80-100 ℃ 之間首次失重，這是由于水分的損失。第二次分解是由于聚合物分子的降解，PAP 和 PAPN 水凝膠的熱分解溫度明顯高于 PA 水凝膠近 110 ℃。拉伸應力-應變測試評估了這些水凝膠的機械強度和穩定性。如圖 4d 所示，與脆弱的 PA 水凝膠相比，PAP 和 PAPN 水凝膠表現出更好的機械性能。例如，PAPN 水凝膠的拉伸強度和伸長率分別約為 126 kPa 和 400%，而 PA 水凝膠的拉伸強度和伸長率分別約為 11 kPa 和 138%。這可能是由于引入苯環后鏈剛度和鏈間相互作用增強的緣故。
圖4 水凝膠在人工唾液中的膨脹率
【PAPN水凝膠的抗菌性能和細胞相容性】
細菌感染對拔牙窩的傷口愈合有很大的威脅。為了探討PAPN水凝膠的抗菌性能，本研究以革蘭氏陽性金黃色葡萄球菌（S. aureus）、革蘭氏陰性大腸桿菌（E. coli）和變異鏈球菌（S. mutans）為代表病原體進行了分析。與對照組相比，與水凝膠共培養后瓊脂平板上的細菌數量急劇下降（圖 5a Ⅰ-Ⅵ），抗菌效率均超過 90%（圖 S10）。用掃描電鏡觀察金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變異桿菌經 PAPN 處理后的形態變化。對照組細菌形態正常，表面光滑，邊緣清晰（圖 5a Ⅶ-Ⅸ）。相比之下，用 PAPN 水凝膠處理后細菌的形態發生了變化，可以觀察到細菌膜明顯凹陷和破裂（圖 5a Ⅹ-Ⅻ）。然后還測量了經 PAPN 處理的細菌懸浮液在 600 納米波長處的吸光度，以進一步揭示 PAPN 水凝膠的抗菌能力（圖 5b、c）。
圖5 水凝膠的抗菌性能
【拔牙窩的傷口愈合】
為了評估 PAPN 水凝膠對拔牙窩傷口愈合的治療效果，本研究制作了大鼠上頜第一磨牙（M1）拔牙窩傷口模型。圖 6a 顯示了大鼠 M1 拔牙模型的構建過程。拔牙后，立即使用 PAPN 水凝膠處理拔牙傷口（PAPN 組）。處理后，可根據需要用溫水簡單地去除 PAPN。對照組則用棉花按壓拔牙窩傷口，半小時后去除棉花（對照組）。此外，還選擇了商用外科醫用多肽（SMP）水凝膠作為陽性對照組。在固定時間（拔牙后 1、3、7、14 和 21 天）采集上頜骨，并對提取的傷口組織樣本進行進一步處理和分析。首先，通過分析蘇木精伊紅（HE）染色的組織切片來評估拔牙窩的傷口愈合過程（圖 6b）。可以觀察到，拔牙后第一天，拔牙窩內充滿血凝塊，粘膜連續性中斷。對照組的圖像顯示了典型的炎癥，大量炎癥細胞浸潤牙齦區域，而血細胞則更多地分散在牙槽窩中。SMP 組和 PAPN 組的炎癥浸潤相對較少，而 PAPN 組的血凝塊最多。血凝塊中含有生長因子和細胞因子，可作為物理支架促進后續的血管生長和骨再生。在拔牙后的初期階段，血凝塊的部分或全部丟失是導致牙槽骨炎的主要原因。PAPN 組中血凝塊的保護有利于拔牙窩的傷口重建。此外，拔牙后出血是不可避免的，因此要求傷口敷料具有良好的血液相容性。為了評估 PAPN 的血液相容性，本研究測試了凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、凝血酶時間（TT）和纖維蛋白原（Fbg）。PAPN 水凝膠與空白無明顯差異，表明 PAPN 對正常凝血過程影響不大。此外，PAPN 的溶血率遠低于 ISO 標準（5%），表明沒有發生溶血現象。
圖6 大鼠上頜第一磨牙（M1）拔牙模型實驗流程圖
白細胞介素-6（IL-6）和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是促炎細胞因子，通過調節免疫和炎癥反應在傷口愈合過程中發揮重要作用。膠原蛋白Ⅰ（COL-Ⅰ）和血管內皮生長因子（VEGF）對傷口愈合過程有很大作用。COL-Ⅰ 以整合素信號依賴的方式介導幾個關鍵步驟，如血小板聚集、炎癥調節、血管生成、肉芽組織形成和再上皮化。血管內皮生長因子是評價傷口愈合的主要指標之一，它能促進早期血管生成，尤其是血管內皮細胞的遷移和增殖。因此，為了進一步評估 PAPN 水凝膠對拔牙傷口的治療效果，本研究分析了傷口愈合過程中 IL-6、TNF-α、COL-Ⅰ 和血管內皮生長因子的表達情況。如圖 7（a-e）所示，與對照組相比，PAPN 組 IL-6 和 TNF-α 的陽性染色強度明顯降低，且 PAPN 組與 SMP 組之間無顯著差異，表明炎癥表達有所降低。此外，PAPN 組在愈合過程中還表現出高水平的 COL-Ⅰ 沉積和血管內皮生長因子。動物實驗結果表明，PAPN 水凝膠具有緩解炎癥、保護血凝塊、促進膠原沉積、血管和骨再生的作用，因此可以加速拔牙傷口的愈合過程。
圖7 第 3 天、第 7 天、第 14 天和第 21 天對 IL-6、TNF-α、COL-Ⅰ 和 VEGF 進行免疫組化染色
2. 總結與展望
總之，本研究成功地設計出了一種抗腫脹、抗菌水凝膠敷料，可快速封閉傷口，并具有可逆粘附性，可用于治療拔牙窩。研究表明，PAPN 具有優異的機械性能（拉伸強度約為 126 kPa）和低腫脹性能（約為 80%），適合在復雜的口腔環境中應用。粘附性測試表明，PAPN 水凝膠在各種基底（玻璃、不銹鋼、聚丙烯、二氧化硅、組織）上都表現出很強的粘附性。此外，PAPN 在溫度控制下具有可逆的粘附性能，處理后可實現按需去除。本研究還驗證了該敷料的抗菌性能，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和痢疾桿菌的抗菌效率均超過 90%。本研究還驗證了敷料的抗菌性能，在體外對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和變異桿菌的抗菌率均超過 90%。在大鼠拔牙模型中，與傳統的棉花加壓治療相比，這種敷料能更有效地緩解炎癥、保護血凝塊、促進膠原蛋白沉積、血管和骨再生。所有這些結果表明，PAPN 水凝膠敷料具有多種功能，可作為治療拔牙窩傷口的一種新的替代療法，在口腔傷口管理方面具有良好的應用前景。
文章來源：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/adhm.202400089
