當血流通過動脈受到限制時，就會發生嚴重的肢體缺血（CLI），導致下游肢體潰瘍、壞死和慢性傷口。側枝小動脈的發育(即動脈生成)，無論是通過重塑已有血管網絡還是新生血管的重新生長，都可以預防或逆轉缺血性損傷，但刺激側枝小動脈的發育仍具有挑戰性。多因子策略雖然有著一定的效果但其臨床轉化的途徑變得復雜。因此，研究者開發出了具有模擬可溶性蛋白質活性的結合肽的水凝膠。
近日，來自美國范德比爾特大學的Ethan S. Lippmann團隊設計了一種新的肽功能化水凝膠用于CLI治療。該研究使用明膠作為水凝膠骨架，用來自1型鈣粘蛋白胞外結構域的肽將明膠功能化，將其稱為GelCad，然后使用支鏈胺反應性聚乙二醇(PEG)聚合物原位交聯成水凝膠。研究表明，在使用再生能力有限的小鼠的嚴重股動脈結扎模型中，GelCad水凝膠在體內強有力地促進側支小動脈的發育，并防止缺血性損傷。
相關研究成果以“Growth factor free, peptide-functionalized gelatin hydrogel promotes arteriogenesis and attenuates tissue damage in a murine model of critical limb ischemia”為題于2023年11月13日發表在《Biomaterials》上。
1. 鈣粘蛋白肽偶聯明膠的合成與表征
基于之前的合成策略，作者進一步使用EDC/NHS反應將肽結合到明膠上，利用核磁證實了明膠上肽的存在(圖1A)。通過流變學、原子力顯微鏡和掃描電子顯微鏡測量，兩種交聯策略都產生了柔軟的多孔水凝膠(圖1B–E)，其基本性能適用于體內使用。
圖1 GelCad水凝膠的表征
2. GelCad水凝膠促進平滑肌細胞向血管結構的募集
先前的工作表明，血管損傷后SMC中的N-鈣粘蛋白表達上調，并調節SMC增殖，假設明膠中鈣粘蛋白模擬肽的存在會增強SMC對血管結構的募集，從而促進小動脈的形成。為了評估這種可能性，作者將小鼠大腦皮層勻漿，暴露血管并模擬損傷情況。然后，將這種離體組織包埋到mTG交聯的明膠、GelCad或“GelScram”水凝膠中(后者含有鈣粘蛋白肽的混雜版本)。如?-SMA信號所示，相對于任一對照，包埋在GelCad水凝膠中的組織在24小時后在凝集素+血管樣結構上具有顯著更高的SMCs覆蓋率(圖2)。
圖2 GelCad水凝膠促進離體組織樣品中平滑肌細胞募集成血管樣結構
3. 在注射到乳房脂肪墊后評價GelCad水凝膠中的小動脈發育
接著，為了建立該研究的體外結果，作者接下來檢查了PEG交聯水凝膠在C57BL/6小鼠乳腺脂肪墊中的性能。水凝膠注射后，首先使用對比增強超聲檢查血管發育。在注射后第7天，可以在明膠和GelCad水凝膠的內部檢測到大血管，在GelCad樣品中可能有更多的血管(圖3A)。然而，很難量化血管特征，因為水凝膠和周圍組織之間的絕對邊緣必須被估計和手工繪制。為了解決這個問題，作者分離了完整的水凝膠用于冷凍切片和免疫組織化學。在GelCad水凝膠中，可以容易地在水凝膠中定位大量α-SMA+血管，指示小動脈形成，而在明膠水凝膠中，可以定位一些假定的小動脈，但是α-SMA信號強度低得多(圖3B)；總小動脈數量的量化揭示了顯著差異(圖3C)，這反映了在圖2中的離體數據。
然后，作者使用Vesselucida軟件追蹤和量化水凝膠中的血管特征(圖3D)。在明膠和GelCad水凝膠中，可以檢測到直徑范圍從50到350微米的血管，表明有小動脈。在GelCad水凝膠中，分支結的數量(表示血管分支點)和血管體積(表示血管網絡的大小)明顯更高。總之，這些結果進一步表明GelCad水凝膠增強了小動脈的發育。
圖3 在小鼠脂肪墊中注射后評價GelCad水凝膠中的小動脈發育
4. 在嚴重肢體缺血的小鼠模型中評價GelCad水凝膠的功效
作者在CLI的股動脈結扎模型中評估GelCad水凝膠平臺的治療潛力。在14天的時間里，我們評估了用明膠、GelScram或GelCad水凝膠治療的小鼠以及接受生理鹽水的假對照小鼠的血流量、活動性和組織質量的恢復情況。與所有其他條件相比，用GelCad水凝膠治療的小鼠在結扎的肢體中有明顯更少的壞死；接受明膠水凝膠或鹽水的小鼠通常在第7至14天因嚴重壞死而失去肢體，這突出了該模型的嚴重性(圖4A和B)。使用Tarlov活動性指數，作者還確定了接受GelCad水凝膠的小鼠在7天后活動性恢復，而接受明膠水凝膠或鹽水的小鼠從未恢復活動性(圖4C)。
圖4 股動脈結扎和水凝膠遞送后小鼠的物理外觀和活動性
這些結果反映了LDPI測量，其中接受GelCad水凝膠的小鼠在14天內具有接近完美的灌注恢復(與健康腿的比例為1∶1 ),而用明膠水凝膠或鹽水治療的小鼠沒有表現出灌注恢復(圖5A和B)。為了進一步證實側支發育，再次用不透射線的聚合物灌注小鼠，進行μCT成像，并使用Vesselucida軟件追蹤和量化健康肢體與用GelCad水凝膠治療的結扎肢體的血管網絡。盡管結扎肢體缺乏通過股動脈的血流，但結扎肢體的總血管長度與健康肢體大致相當，且血管直徑無顯著差異(圖5C-E)——這些數據表明通過增加側枝密度來補償血流。
圖5 股動脈結扎和水凝膠遞送后灌注的恢復
最后，作者使用半定量指標對肌變性、肌壞死、骨細胞損失、中心核、纖維化和骨髓壞死進行了組織病理學評估(圖6)。相對于所有其他條件，用GelCad水凝膠治療的小鼠具有明顯較輕的肌肉退化以及肌肉和骨髓壞死。在用GelCad水凝膠治療的小鼠中，壞死幾乎完全不存在，但在所有其他情況下，壞死普遍存在。此外，在用GelCad水凝膠治療的小鼠中沒有觀察到骨細胞損失，而在其他條件下有輕微損失。因此，GelCad水凝膠防止由缺血性損傷引起的組織變性，可能是通過側枝發育快速恢復血流。
圖6 接受不同水凝膠治療的結扎后肢的組織病理學
在這些陽性結果的支持下，作者選擇了兩只接受股動脈結扎和GelCad水凝膠治療的小鼠，并將其老化5個月，以評估治療反應的長期持久性。在最后，小鼠具有正常的行走，并且在結扎的肢體中沒有可見的壞死跡象(圖7A)。LDPI成像顯示在結扎的和健康的肢體之間有接近1∶1的灌注比，表明側支網絡的強健和對來自股動脈的減少的循環的持續補償(圖7B和C)。
但是在μCT圖像中對側枝網絡的追蹤揭示了總血管長度的潛在增加，而不是血管直徑的增加，這潛在地暗示了在這個延長的時間點上新側枝血管的生長(圖7D–F)。因為可以認為GelCad水凝膠產生了這種持久的反應，未來的工作將集中在分析這些延長的時間點，以更好地了解側枝發育的長期機制，作為這些水凝膠的功能。
圖7 股動脈結扎和用GelCad水凝膠治療后5個月的小鼠的評價
綜上，這項研究中評估了鈣粘蛋白肽功能化明膠水凝膠的動脈生成活性。作者確定了該肽在將SMCs募集到血管中起著關鍵作用，這促進了體外和體內小動脈的發育。在一個嚴重的CLI模型中，GelCad水凝膠有助于血流恢復，并在數月內防止缺血性組織損傷。總的來說，該研究表明GelCad水凝膠在CLI和其他有益于側支小動脈發育的情況下具有很好的治療潛力。
文章來源：https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2023.122397
