一、研究背景
天然細胞外基質由多種蛋白質組成，具有相互連接的分層結構，是引導組織組裝的理想材料。然而，這些基質的體外使用受到批次間變異性和免疫原性問題的影響。因此，發現合成替代品仍然是細胞生物學家和組織工程師的主要目標。為了實現這一目標，由自組裝合成肽組成的水凝膠因起始材料的一致性、合成的簡易性、生物可降解性和低細胞毒性而受到廣泛關注。這些合成水凝膠的設計目的是形成肽納米纖維的糾纏網絡，模擬天然基質的結構特征，包括網眼尺寸、孔徑和納米纖維結構。
新的肽水凝膠支架通常是通過對超短疏水肽（2-5 個殘基）進行官能化而設計的，這些肽具有大的 N-末端封端基團，可通過活塞堆積相互作用促進自組裝。肽兩親性化合物是另一類凝膠劑，依靠疏水和親水結構域的排列來驅動自組裝。自互補離子凝膠劑通常由較長的多肽（8-16 個殘基）組成，其帶電氨基酸交替排列，通過靜電作用進行自組裝。另一種方法是合理設計肽序列，模仿天然存在的二級蛋白質結構，如α螺旋或β薄片。盡管對超分子肽組裝進行了廣泛的研究，但發現新的水凝膠劑的動力往往來自偶然性或對已有凝膠劑序列的排列組合。
色氨酸拉鏈（Trpzip）是一種相對尚未開發的組裝基序。該基序的特點是四個交叉鏈色氨酸殘基通過吲哚環相互鎖定，將多肽折疊成β發夾構象。由于這種高度穩定的拉鏈效應，Trpzip 肽可以形成短至 12 個氨基酸的β發夾。這比以前報道過的β-發夾水凝膠劑（如 MAX 肽）要短得多，后者依靠四肽（-VDPPT-）單元和較長的序列（>20 個氨基酸）來維持折疊發夾結構。以前的工作表明色氨酸有望成為自組裝水凝膠的構件；然而，這些系統仍然依賴于結合使用其他非天然疏水分子（如苯或萘殘基）或常規的肽凝膠基團（如二苯基丙氨酸）來幫助驅動凝膠化。雖然 Trpzip 序列僅在數周內就能組裝成納米纖維，但其作為一種新的自組裝結構基序的潛力是顯而易見的。不過，Trpzip 肽基序尚未用于形成水凝膠。
二、研究成果
在這項工作中，新南威爾士大學Kristopher A. Kilian教授團隊利用分子動力學模擬設計了一種基于 Trpzip 基序的多肽水凝膠劑。他們的 Trpzip 肽能在幾分鐘內分層組裝，首先形成長納米纖維，然后組裝成具有周期性結構的微尺度結構域。由此產生的水凝膠顯示出具有可調模量、自愈合和應力松弛特性的熱膨脹性凝膠，即使沒有細胞粘附基序，也能保持細胞活力和擴散性，并具有抗菌活性。添加短粘附肽對水凝膠的機械特性影響極小，而添加細胞外基質蛋白（如層粘連蛋白）則可培養成體干細胞和誘導多能干細胞衍生的腸器官組織。該材料的低屈服應變有利于在剪切力作用下快速流化，提供了一種簡單的機制來回收嵌入的細胞和組織，并通過注射器分散含有細胞的 Trpzip 凝膠，從而實現細胞遞送和生物打印應用。相關研究工作以“Hierarchical assembly of tryptophan zipper peptides into stress-relaxing bioactive hydrogels”為題發表在國際頂級期刊《Nature Communications》上。祝賀！
三、圖文速遞
圖1. 通過粗粒度分子動力學模擬識別易發生納米纖維聚集的 Trpzip 序列
Trpzip 肽基序能夠合成迄今為止報道的最短β發夾（圖 1a）。Trpzip 肽的設計初衷是為了研究蛋白質折疊的熱力學，但事實證明，Trpzip 肽序列的微小變化就能極大地改變聚集和納米纖維的形成（圖 1b）。
他們對所有二十種 Trpzip1 肽變體進行了 MD 模擬，并對每次模擬的最后一幀進行了目測評估（圖 1c）。通過從每次模擬中提取最大的多肽聚合體并將它們排列在同一軸上來比較所有變體，他們發現與原始序列相比，纈氨酸取代的聚合模式差異最大（圖 1d），他們將其命名為 Trpzip-V。量化所有 20 個變體的最大肽簇的慣性矩證實，纈氨酸取代的變體形成的大聚集體在形態上最具纖維性，而 Trpzip1 則形成小球形聚集體（圖 1e）。
圖2. Trpzip 水凝膠的合成、優化和表征
圖3. Trpzip 水凝膠的力學特征
為了評估 Trpzip 水凝膠的機械特性，他們對不同肽濃度的凝膠進行了原位振蕩平行板流變儀測試。Trpzip 水凝膠的硬度隨肽含量的增加而增加，G'值范圍為 1-60 kPa，所有凝膠在大約 12 小時后達到平衡儲存模量（圖 3a）。Trpzip 凝膠的凝膠化行為與溫度有關，37 °C 時的硬度比 20 °C 時高十倍（圖 3b）。令人驚訝的是，Trpzip 凝膠的屈服點出現在剪切應力約為 75 Pa 時（圖 3c）。這與他們觀察到的凝膠在中等壓力下快速流化的現象一致。Trpzip 凝膠還表現出剪切稀化行為（圖 3d），粘度與剪切率成正比線性下降，這表明它可能是擠壓和生物制造的理想生物材料。由于其他肽水凝膠可以可逆地組裝和分解其物理交聯網絡，他們對 Trpzip 凝膠進行了觸變性測試，以確定它們在剪切后的自我修復和恢復速度。在 5%應變下暴露 5 分鐘后，水凝膠會在剪切力停止后立即重新交聯，并在一小時內恢復到初始硬度（圖 3e）。
天然組織的一個重要方面是能夠顯示出應力松弛等非線性粘彈性特性，這對于分散組織擴張和形態形成過程中產生的細胞力至關重要。為了評估 Trpzip 凝膠是否具有類似的應力松弛曲線，他們進行了恒定剪切變形測量（圖 3f），并將 Trpzip 凝膠（1% w/v）的應力松弛半衰期與天然基質 Matrigel 和聚乙二醇二甲基丙烯酸酯（PEG-DM）水凝膠進行了比較。不出所料，PEG-DM 因其共價交聯網絡而幾乎沒有應力松弛；然而，由于其動力學性質，Trpzip 凝膠顯示出與 Matrigel 相似的應力松弛曲線。他們發現 Trpzip 凝膠的應力松弛半衰期（58.5 ± 0.4 秒）低于 Matrigel（87.1 ± 0.76 秒）（圖 3g），但在其他天然基質的范圍之內。天然材料的另一個重要方面是細胞粘附基序的存在。他們研究了在 Trpzip 水凝膠中添加層粘連蛋白衍生的 Ile-Lys-Val-Ala-Val (IKVAV) 粘連基序的效果。與純 Trpzip 凝膠相比，將 Trpzip-IKVAV（200 μΜ）整合到 Trpzip 凝膠中不會導致硬度發生統計學意義上的顯著變化（圖 3h）。
圖4. Trpzip 水凝膠支持細胞生長、注射器擠壓、生物制造，并具有抗菌特性
圖5. 與 Matrigel 相比，在 Trpzip 水凝膠中培育成體干細胞衍生的腸器官組織
四、結論與展望
他們的工作展示了一種基于色氨酸拉鏈基序的多肽水凝膠，它能自組裝成具有獨特機械和生物特性的納米和微結構材料。Trpzip 水凝膠很容易形成，無需嚴格的溫度控制，這通常是天然基質所需要的。這種材料的模量可調，屈服應力低，是首例可改變粘彈性的材料，可通過簡單的攪拌快速收獲，從而直接實現生物功能。這將被證明對分子表征非常有益，因為分子表征通常需要以酶為媒介對周圍基質進行侵入性溶解。同樣，低屈服應力和自愈合特性為注射器擠壓提供了一種方法，分層材料的流化可保護細胞免受剪切力的影響，從而應用于細胞輸送和生物制造。考慮到這些水凝膠對哺乳動物細胞同時具有殺菌和生物活性，Trpzip 水凝膠在體外和體內作為治療生物材料的應用前景十分廣闊。
文獻鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-41907-1
