反相液相色譜方法開發(fā)色譜柱的選擇一般有兩種方法，一種是基于實際經(jīng)驗，另一種則是基于理論知識，包括固定相和分子的化學(xué)性質(zhì)。今天我們來聊一聊如何基于理論知識選擇合適的色譜柱。首先我們要了解目標分子中存在的官能團，以及它們是如何與固定相相互作用的。
一、化合物中常見基團的作用力
1. 亞甲基
在亞甲基鏈是CH2的情況下，存在其他官能團，那么該官能團的極性很低或幾乎是非極性的。非極性分子，可以與倫敦分散力模式下的固定相相互作用，保留機制主要由倫敦分散力決定。
2. 苯基
苯基，存在倫敦色散力，同時也有少量π-π相互作用，能有助于化合物的保留。
3. 鹵化物：F、Cl、Br、I
鹵化物中的F、Cl、Br、I都具有很強的電負性，這些化合物在自然界中都是極性的，會帶來偶極-偶極相互作用。如果分子中有鹵素原子，那么分子可以通過偶極-偶極相互作用與固定相相互作用，再加上亞甲基或羰基鏈還能帶來一定的倫敦色散力。
4. 醚基
醚，氧也是高度電負性的原子，這也會帶來偶極相互作用，加上倫敦色散力，因為氧的兩側(cè)都有烷烴基團。除此之外，如果另一種化合物上有氫，這種氧也可以與其形成氫鍵，所以醚可以通過倫敦色散力、偶極相互作用，甚至通過氫鍵，保留在固定相上。
5. 硝基
硝基也是極性官能團，氮是電負性很強的元素，所以會發(fā)生偶極相互作用和氫鍵作用。
6. 酯基
酯，存在倫敦色散力、偶極相互作用和氫鍵作用。
7. 醛基
醛，存在倫敦色散力、偶極相互作用和氫鍵作用。
8. 酮基
酮，由于烷烴鏈，存在倫敦色散力，以及氧原子的高電負性，存在偶極作用力。在酮官能團上存在的氧也可以形成氫鍵。
9. 氨基酸
由于烯烴鏈是高度非極性的鏈，它可以通過倫敦色散力的機制與狀態(tài)界面相互作用，因此氨基酸可以在倫敦色散力的作用下得到保留。此外，由于氨基中存在氮，因此具有偶極相互作用，這種氮也可以與具有氫原子的化合物形成氫鍵。
10. 酸堿基團
如果固定相中有一些酸堿官能團，如羥基是R-OH，R可以帶來倫敦色散力，氧是電負性很強的原子，能引起偶極-偶極作用，它還能與另一個含氫的化合物形成氫鍵。羧酸的倫敦色散力是由于烯烴鏈的偶極子，偶極子是由于氧原子存在于羧酸官能團內(nèi)部，形成氫鍵。
這些就是化合物能保留在固定相上的主要原因。
二、案例分析-1
現(xiàn)在讓我們通過實際的例子來理解，假設(shè)必須分離潑尼松和潑尼松龍。首先了解這兩個目標分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，圈出不同的結(jié)構(gòu)特征，需要確定這些結(jié)構(gòu)特征是什么或者這兩個分子中不同的官能團是什么，來了解其中的差異。
通過觀察我們可以發(fā)現(xiàn)，Prednisolone存在羥基，而在Prednisone結(jié)構(gòu)式中同樣的位置是羰基。我們使用最廣泛的固定相中，第一種是烷基鍵合的固定相，如C8、C18，第二種是氨基，第三種是苯基五氟苯基（PFP），然后是氰基，最后是未鍵合的純硅膠。因此，我們嘗試分析潑尼松龍和潑尼松的保留情況。
我們知道C18固定相本質(zhì)上是高度非極性的,是高度疏水的，它們只會保留高度疏水或非極性的分子。Prednisolone和Prednisone結(jié)構(gòu)中存在許多π鍵、雙鍵以及氧這種高負電性原子，這將使這兩種化合物是高度極性的，所以C8或C18不會是首選。在這兩種固定相上，Prednisolone和Prednisone的保留時間幾乎相同，并且保留很弱，因為這兩種化合物與烷基鍵合的固定相相互作用的可能性很小。
再看看酰胺固定相，酰胺固定相上存在氮，可以形成氫鍵，因此酰胺固定相將與極性化合物Prednisolone和Prednisone相互作用。Prednisolone具有與氧一起可用的氫，但在Prednisone的情況下，該氫缺失或共享，因此該羥基可以與酰胺固定相有更多的相互作用。由于目標化合物和固定相都有較強的極性，因此，化合物將有更好的保留，但由于氫鍵的形成，Prednisolone具有更強的保留，因此，可以考慮采用酰胺固定相來進行分離。
苯基固定相，苯環(huán)是路易斯堿，它可以通過π-π作用力或氫鍵作用力進行相互作用。與Prednisolone相比，Prednisone缺少可形成氫鍵的氫，因此，苯基固定相很有可能與Prednisolone的相互作用更好。這樣，就可以實現(xiàn)兩種化合物的分離。但苯基在性質(zhì)上極性不是很強，因此，保留時間可能很短，正因為如此，苯基可能也不是首選固定相。
現(xiàn)在來看看五氟苯基，這個五氟苯基是一個極性很強的固定相，因為有五個氟原子。氟是高電負性原子，它能非常強烈地吸引極性化合物，存在強烈的偶極-偶極相互作用。因此，在PFP上這兩種化合物可能會獲得良好的保留。羥基上的氫可以和氟原子形成氫鍵，從而使這兩種化合物分離，PFP是個不錯的選擇。
氰基柱，是極性很強的色譜柱，氰基也可以形成氫鍵，因此，根據(jù)兩種化合物形成氫鍵的能力不同，可以進行分離，也是不錯的選擇。
最后是二氧化硅，它是極性很強的固定相。這兩種化合物都是極性化合物，所以二氧化硅也可以成為另一種選擇，但可能需要使用正常相模式。
三、案例分析-2
再舉一個例子。在這個例子中，甲苯和乙苯作為兩種不同的化合物，要將它們分離出來。甲苯和乙苯的區(qū)別是什么？是烯烴鏈。乙苯上有額外的CH2單元，烯烴鏈具有疏水性。
這種情況下，讓我們了解下哪種固定相是首選？甲苯和乙苯的主要區(qū)別在于疏水性有差異，而烷基鍵合固定相就是基于疏水性的保留，因此，C8和C18可以是該分離的優(yōu)選固定相。酰胺的烷基鏈也可以帶來一定的疏水性，但與C8和C18相比，它并不是最佳選擇。苯基在自然界中是非極性的，也可能不適合，PFP毫無疑問，在性質(zhì)上也是高度非極性的。氰基是一種極性很強的固定相，對于這兩種化合物的分離作用不大。現(xiàn)在我們可以知道，C8或C18甲苯和乙苯的分離是最有幫助的，因為它們能帶來分離這兩種化合物所最需要的疏水作用。
四、案例分析-3
現(xiàn)在讓我們來考慮一下稍微復(fù)雜一點的情況，這是一種混合物，包含6種不同的化合物，需要將它們分離。我們已經(jīng)了解到具有不同官能團的化合物，它們很容易被分離，但是在具有類似官能團類似結(jié)構(gòu)的化合物中，分離就會面臨挑戰(zhàn)。
我們先找出在結(jié)構(gòu)上非常相似的兩種化合物，然后確定它們的官能團有什么不同，因為不同官能團的不同交互作用可以幫助我們將其分開。現(xiàn)在再來看看固定相，C8或C18這種烷基鍵合的固定相，它們控制這分子的疏水性，而這兩種分子在自然界中是非常親水的，它們是極性的。正因為如此，C8或C18可能并不是首選。酰胺固定相有助于保留極性官能團，化合物1中的NH2可以和酰胺固定相形成氫鍵，與化合物2相比，它可以得到更長的保留時間。因此，酰胺可以作為首選固定相。苯基，在這里也有一定的幫助，因為化合物1中存在苯環(huán)，而化合物2中沒有苯環(huán)，因此，化合物1可以與苯基固定相發(fā)生π-π相互作用，得到更好的保留。此外，由于其極性，苯環(huán)還會帶來偶極=偶極作用，化合物2也能得到一定的保留。PFP也是一種很有趣的固定相，五氟苯基與化合物1的兩個苯環(huán)與之間有π-π相互作用，它還能與NH2形成氫鍵，因此，化合物1與PFP固定相有更大的親和力，最終可以獲得這兩種化合物的良好分離。另一個是氰基，這也是一種非常有趣的固定相，因為它在自然界中也是一種極性很強的固定相，而我們的目標化合物的極性也很強。氰基能引起偶極-偶極相互作用，它的C-N三鍵也能與化合物1的NH2發(fā)生氫鍵作用。二氧化硅在這里不是首選，因為可能要用到正相色譜。
五、小結(jié)
在反相液相色譜方法的開發(fā)中，如果能從理論上分析化合物的這些官能團性質(zhì)如何與固定相上的官能團進行相互作用，可以有效地縮小色譜柱的選擇范圍，然后進行試驗，獲得理想的色譜柱。
