在色譜分析過程中常常需要使用緩沖鹽來調節流動相的pH值，緩沖鹽的不當使用對色譜柱可能造成柱壓升高、柱效下降以及使化合物的保留時間發生變化等影響，緩沖鹽使用不當對色譜柱的影響及解決辦法。
緩沖鹽是指對pH有緩沖能力的鹽，能夠讓pH維持在一個恒定的數值。
何時應用緩沖鹽
樣品或樣品中需研究的關鍵雜質有離子化傾向，其他特定少數情況另行敘述。
存在較強離子化傾向的組分，其中一部分是分子狀態，與反相色譜固定相結合的更好；另一部分是離子狀態，更親和于流動相。如不使用緩沖鹽控制其電離狀態，即分子狀態和離子狀態的比例，很容易出現峰拖尾分叉變形的情況。這種情況下一般就不應該使用水/有機相系統作為流動相，應選用緩沖鹽/有機相系統。
常見的緩沖鹽有哪些
緩沖鹽類型的選擇，主要取決于所需要的緩沖能力，在反向色譜中，流動相中水相的pH和離子強度在開發對條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對于離子型化合物，典型的樣品的保留隨pH改變而明顯變化。通常在pH2到4條件下，保留時間對pH的微小改變穩定性最高。因此建議將這一pH范圍作為大多數樣品方法開發的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。緩沖鹽溶液的pH值越接近其pka，緩沖能力越強。一般緩沖鹽溶液的pH值應在其pka±1的范圍內。
比起單純的酸堿，鹽類，特別是具有緩沖能力的鹽類可以很好的控制流動相的pH值，根據不同緩沖鹽中兩種鹽的配比，可以很容易的配置出一定pH的緩沖溶液。
1、甲酸鹽
通常在液相色譜中常用的甲酸鹽都是甲酸銨，這類鹽的溶解度好，完全兼容液質聯用的方法，對色譜柱的傷害也比較小，但是缺點是離子強度比較低，另外就是甲酸鹽比較容易吸潮，稱量的時候比較困難，在流動相里還可能揮發。與甲酸配合，可以得到甲酸-甲酸銨緩沖體系，大概緩沖能力在pH3～4.5的范圍之內，只要調節兩者濃度的比例即可。
2、乙酸鹽
常見為乙酸銨，在使用上，和甲酸鹽十分類似，離子強度也不高，與乙酸配合的乙酸-乙酸銨緩沖體系pH的控制能力在pH4～5.5左右。
3、磷酸鹽
常用的是磷酸的鈉鹽和鉀鹽，二者對pH的控制能力十分接近，只是離子強度稍有差異，絕大多數情況下是可以互換使用的，磷酸由于是多元酸，能夠形成一氫鹽和二氫鹽，所以使用磷酸緩沖體系調節pH也是組合比較多，跨度比較大的，并且可以提供較高的離子強度，可惜，磷酸鹽流動相體系無法兼容質譜，并且對色譜柱損傷較大。
以磷酸鈉鹽為例，可以有以下兩種組合的緩沖體系：磷酸-磷酸二氫鈉：pH可以達到1.2～3.1左右的范圍；磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉：pH可以達到6.5～8左右的范圍。
上述的緩沖對能調節的pH范圍指的都是在保持緩沖能力的范圍之內，如果僅僅是調節pH的話，范圍還可以再擴展一些。
緩沖鹽使用不對產生的影響
1、柱壓升高
原因：緩沖鹽使用不當導致緩沖鹽析出，堵塞塞板和鍵合相顆粒之間的孔隙，阻礙流動相傳質，引起柱壓升高。
2、相同化合物的保留時間發生變化
原因：如果沒有沖洗干凈就進行進樣，色譜柱內含有的鹽會使化合物的保留時間發生變化。
3、柱效下降
原因：
1）有些緩沖鹽會滲入到鍵合相的深處，損害硅膠基體，導致色譜柱鍵合相流失，柱床變松，柱效下降；
2)凝結在鍵合相表面，使C18碳鏈難以舒展，對物質的保留能力下降，導致柱效下降。因此用過緩沖鹽后需要對色譜柱進行沖洗，水中緩沖鹽濃度較大時應特別引起注意。
緩沖鹽的正確使用方法
1、使用前的處理：在使用緩沖鹽作流動相之前需要用不含緩沖鹽的流動相沖洗色譜柱，直至基線平穩。原則上，用于沖洗的流動相與分析時所用的流動相含水的比例相同(或含水更多)，不同的只是用于沖洗用的流動相中不含緩沖鹽。
理由：緩沖鹽通常易溶于水，難溶于有機溶劑。用含緩沖鹽的(特別是做流動相的水為飽和的緩沖鹽溶液時)流動相進行分析時，如果分析前色譜柱中用于保存色譜柱的流動相中含水的比例相對較小，不先沖洗掉，接下來做樣品的時候所用的流動相中如果有機溶劑含量大，而其比例中所含的水又不足以溶解該緩沖鹽時，緩沖鹽將會在色譜柱柱體上析出，沉積下來，這將可能導致上述對色譜柱的損害。
2、使用后的處理：用與分析時含水比例相同的流動相(與分析用流動相唯一的區別是，用于沖洗的流動 相不含緩沖鹽)進行沖洗約30min，直至基線平穩。如果該色譜柱在接下來很長的一段時間內不使用，要長期保存，則需再加上一步，即用純的有機溶劑沖洗一遍，直至基線平穩。
用與分析時含水比例相同的流動相(與分析用流動相唯一的區別是，用于沖洗的流動相不含緩沖鹽)進行沖洗約30min，直至基線平穩。如果該色譜柱在接下來很長的一段時間內不使用，要長期保存，則需再加上一步，即用純的有機溶劑沖洗一遍，直至基線平穩. 緩沖液可以提供離子平衡的反離子，并使流動相保持一定的離子強度和ph值，減少拖尾。
使用緩沖液要注意幾點
1、避免使用鹽酸鹽，鹽酸鹽對鋼質有腐蝕作用。
2、緩沖液最好要現配現用，往往緩沖液是良好的菌類培養液，隔天或放置長時間實驗時會有很多怪現象發生。
3、實驗后不可用有機溶劑直接過度，有機溶劑會處使鹽類析出，造成液路或色譜柱堵塞，可用95：5的水甲醇沖洗。
4、使用緩沖液要及時掌握ph范圍，做到胸中有數。
5、清洗液路和柱子時，有溫控可加熱到30攝氏度易于沖洗。
6、長時間用緩沖溶液要注意觀察接頭處有無析出，若有白色鹽類析出，可考慮一定周期用10%硝酸沖洗一下液路(拆下柱子，走30ml，再用5倍水沖洗)可以避免液路的堵塞。
7、選擇緩沖液要用可靠的試劑，避免不純的鹽類造成不必要的麻煩。
如果流動相中有機溶劑的比例很高是不能用來沖洗緩沖鹽的，是洗不出來的。通常C18柱先用5%~10%的甲醇沖洗，是可以把緩沖鹽沖洗出來的，然后用純的有機溶劑來保護柱子。最好的方法是使用與流動相相同濃度不含鹽的流動相進行清洗。但就是速度慢一些。用水是為了快速替換，一般在15分鐘以內最好，且用0.8的流速較好. 如果用純水沖，容易造成鍵合的碳鏈的流失，最好用5%~10%甲醇水溶液沖. 可以用純水代替流動相中的緩沖液，有機相不變。這樣沖洗柱子比較穩妥。
流動相流速的選擇
因柱效是柱中流動相線性流速的函數，使用不同的流速可得到不同的柱效。對于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對內徑為4.6mm的色譜柱，流速一般選擇1ml/min，對于內徑為4.0mm柱，流速0.8ml/min為佳。當選用最佳流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。
注意：
a.由于甲醇廉價，對于反相柱推薦使用甲醇體系(必須使用乙腈的場合除外)。
b.對于正相柱推薦使用沸程為30-60℃的石油醚或提純后的己烷作流動相，沒有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水(電阻率大于18兆歐)，去離子水及雙蒸水中含有酚類雜質，有可能影響分析結果。
c.含水流動相在實驗前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細菌生長。
d.流動相要求使用0.45µm濾膜過濾，除去微粒雜質。
e.使用HPLC級溶劑配制流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命，提高柱性能。
小結
正確使用緩沖鹽很有必要，既可以防止緩沖鹽析出，也可以達到提高色譜柱使用壽命的目的。我們不妨用一句話來總結它的使用方法：用前要過濾，用后需沖洗。
