眾所周知，基因毒性雜質(zhì)具有致突變性和/或致癌性，會(huì)對(duì)DNA造成極大的損傷，進(jìn)而嚴(yán)重危害人類的生命健康。因此，無論食品、藥品、化妝品領(lǐng)域，對(duì)于基因毒性雜質(zhì)的控制要求極其嚴(yán)格，而在藥品領(lǐng)域最為嚴(yán)格。常見的基因毒性雜質(zhì)類型有黃曲霉毒素、苯并芘胺、亞硝胺。這類雜質(zhì)的有效控制離不開穩(wěn)定、準(zhǔn)確、可靠的分析方法，本文匯總了藥物中常見的基因毒性雜質(zhì)分析方法，主要包括前處理方法和定量方法，旨在為廣大研究者在基因毒性雜質(zhì)分析方法的選擇、開發(fā)和驗(yàn)證提供思路。
一、前處理方法
傳統(tǒng)的前處理方法包括用溶劑直接溶解、濃縮、沉淀、離心、萃取、衍生化法等。其中，用溶劑直接溶解是最簡(jiǎn)捷、最實(shí)用的方法，此方法幾乎可避免組分損失，供試品溶液最具代表性，關(guān)鍵在于選擇合適的溶劑，但有的組分不易尋找良溶劑或供試品溶液的測(cè)試靈敏度欠佳，或基質(zhì)干擾較嚴(yán)重，此情況下則需選用其他的前處理方法。然而，其他的前處理方法各有弊端：濃縮法消耗時(shí)間較長(zhǎng)；離心法引起的誤差較大；沉淀法、萃取法有機(jī)溶劑消耗大，污染環(huán)境，影響操作人員健康；衍生化法處理時(shí)間較長(zhǎng)，且有時(shí)衍生試劑不易尋找，加入量不易控制。以上各前處理的操作均不如直接溶解法那樣簡(jiǎn)捷。
近年來，隨著前處理技術(shù)的不斷進(jìn)步，幾種新型前處理方法相繼面世，如固相萃取法（SPE）、固相微萃取法（SPME）、液相微萃取法（LPME）、加速溶劑萃取法（ASE）、微波萃取法（MAE）、超臨界流體萃取法（SFE），其中應(yīng)用較廣的為固相萃取法（SPE）和固相微萃取法（SPME）。固相萃取法具有凈化與富集效果好；樣品制備快速、涉及人工少、溶劑用量少；分析結(jié)果的精密度較高(偏差常<5 %)；多樣化的產(chǎn)品設(shè)計(jì)可迎合不同樣品通量要求等優(yōu)點(diǎn)；固相微萃取法除了具備固相萃取法的制備快速、操作簡(jiǎn)便、易自動(dòng)化外，需要的溶劑用量更少甚至無需洗脫溶劑，所需的樣品體積也較少，還易于和其他技術(shù)聯(lián)用。新型前處理技術(shù)的出現(xiàn)，既去除了樣品基質(zhì)中較多的雜質(zhì)，很好地減弱了基質(zhì)效應(yīng)的影響，又改善了傳統(tǒng)前處理方法的操作復(fù)雜、耗時(shí)、溶劑消耗量大等缺陷，代表了未來前處理技術(shù)的發(fā)展方向。
二、定量方法
定量方法常見的有氣相色譜法（GC）、液相色譜法（HPLC）以及色譜-質(zhì)譜（MS）連用法，如GC-MS、GC-MS/MS、LC-MS、LC-MS/MS，此外還有熱能分析法（TEA）、紫外光譜法（UV）、離子色譜法（IC）等。
2.1 氣相色譜法（GC）
GC法適用于揮發(fā)性較好，熱穩(wěn)定性較強(qiáng)的化合物，如N-亞硝胺類、烷基磺酸酯類、鹵代烷烴類、環(huán)氧類等某些雜質(zhì)。此方法也是最早被發(fā)現(xiàn)的針對(duì)基因毒性雜質(zhì)的分析方法—1981年由Castegnaro M[1]等首次用GC-TEA法對(duì)含氨基拉明、二硫磷和土霉素的藥物進(jìn)行N-亞硝胺類化合物的檢測(cè)。GC 的進(jìn)樣方式包括直接進(jìn)樣和頂空進(jìn)樣（HS）：前者更適合高沸點(diǎn)的物質(zhì)，但基質(zhì)污染較大，前處理過程往往較復(fù)雜；后者的前處理過程較簡(jiǎn)單，基質(zhì)污染少，可提高靈敏度，但是對(duì)于不易揮發(fā)、高沸點(diǎn)的物質(zhì)不太適用。但是GC法靈敏度較低，僅適用于基因毒性雜質(zhì)含量高且溶解性好的原料藥或制劑。隨著近年來ICH和各國(guó)藥物監(jiān)管部門對(duì)基因毒性雜質(zhì)提出了更高的控制要求，此類雜質(zhì)的限度也非常低，通常在100 ppm以下，因此對(duì)于儀器靈敏度的要求也隨之提高，這就導(dǎo)致GC法在基因毒性雜質(zhì)分析方面應(yīng)用并不廣泛。
2.2 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）
GC-MS法目前在測(cè)定基因毒性雜質(zhì)方面得到了較為廣泛的應(yīng)用，該法利用了質(zhì)譜儀的準(zhǔn)確、快速、靈敏度和分辨率高等優(yōu)點(diǎn)進(jìn)行定性和定量分析，解決了單獨(dú)用GC時(shí)方法靈敏度低的問題，檢測(cè)限甚至可低至1 ppb[2]。還能最大限度減少干擾，滿足基因毒性雜質(zhì)痕量分析的要求。GC-MS的電離方式主要有電子轟擊離子化（EI）和化學(xué)電離（CI）兩種，分析器主要是單四極桿（MS）和三重四極桿（MS/MS）。若雜質(zhì)限度在 1~100 ppm，可以采用 GC-MS 方法，通常采用EI電離 模 式 ；若雜質(zhì)的限度低于 1 ppm，推薦使用 GC-MS/MS 法。一般情況下，三重四極桿可降低基質(zhì)干擾（共流出物的碎片或同位素峰）引起的假陽性的發(fā)生率，因此三重四極桿的靈敏度和準(zhǔn)確度更高。
GC-MS法在亞硝胺類、甲磺酸酯類、纈氨酸衍生物等雜質(zhì)方面應(yīng)用較為廣泛。各國(guó)藥典和藥物監(jiān)管部門也收錄了許多運(yùn)用GC-MS的檢測(cè)方法，詳見表1，其中，GC-MS法在沙坦類藥物的分析較為成熟，廣大研究者可引以為鑒。
▲表1-各國(guó)藥物監(jiān)管部門和藥典收錄的部分GC-MS法
2.3 液相色譜法（LC）
液相色譜法（LC）適用于分析沸點(diǎn)高或沸點(diǎn)低但熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)，主要適用的基因毒性雜質(zhì)有芳基磺酸酯、芳香胺，亞硝胺類雜質(zhì)也適用于LC法。然而，采用液相色譜法（LC）分析基因毒性雜質(zhì)，關(guān)于這方面的報(bào)道比較少，主要原因與GC法相同：LC法適用的雜質(zhì)限度通常在100 ppm 以上[11]，但是各國(guó)藥品監(jiān)管部門普遍對(duì)這類雜質(zhì)限度要求及其嚴(yán)格，如目前EMA 和FDA 對(duì)N-亞硝胺類雜質(zhì)要求不得超過30 ppb [12, 13]。因此，LC法的靈敏度不足限制了其在基因毒性雜質(zhì)領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。從各國(guó)藥品監(jiān)管部門的收錄情況來看，只有法國(guó)國(guó)家藥品和保健品安全管理局發(fā)布了HPLC-UV法檢測(cè)纈沙坦原料藥及制劑中NDMA[14]。其他研究者的報(bào)道中，謝衛(wèi)鋒等[15]建立了一種快速簡(jiǎn)便的HPLC法對(duì)托吡司特中的對(duì)甲苯磺酸異丙酯、對(duì)甲苯磺酸仲丁酯和對(duì)甲苯磺酸乙酯進(jìn)行了測(cè)定。
2.4 液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）
液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）具有高靈敏度、高分辨力、快速分析、結(jié)果準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能夠滿足痕量毒性雜質(zhì)測(cè)定的要求[16]。此方法已逐步取代LC法用于痕量雜質(zhì)的分析，在基因毒性雜質(zhì)領(lǐng)域（尤其是揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性較差的雜質(zhì)）應(yīng)用較廣泛。另外，LC-MS法相對(duì)GC-MS法靈敏度更高，離子源和分析器種類也更多。離子源最常用的是電噴霧電離源（ESI）和大氣壓化學(xué)電離源（APCI）；分析器除了單四極桿（MS）和三重四極桿（MS/MS）外，還包括飛行時(shí)間分析器（TOF）、軌道阱（Orbitrap）和離子阱（Iontrap）等。目前液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)中應(yīng)用最廣泛的分析方法是LC-MS/MS，尤其是對(duì)于限度較低（<1 ppm）的雜質(zhì)而言，此法是最合適的，因?yàn)長(zhǎng)C-MS/MS 方法可降低基質(zhì)干擾造成的假陰性（離子抑制）或假陽性（共流出物或同位素干擾）發(fā)生可能性，可以滿足較嚴(yán)格的靈敏度、專屬性和準(zhǔn)確度要求。若 雜 質(zhì) 限 度 在 1~100 ppm， 也可 以 采 用LC-MS 方法，通常采用 ESI 正離子模式 ；但根據(jù)離子化基團(tuán)的特性，ESI 負(fù)離子可能在某些情況下更合適，如-COOH ；對(duì)于難離子化的化合物，通常采用 APCI。
LC-MS法憑借離子源和分析器種類多的優(yōu)勢(shì)，已發(fā)展成為在基因毒性雜質(zhì)分析領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的方法。例如，各國(guó)藥品監(jiān)管部門公布的亞硝胺類雜質(zhì)分析方法中，LC-MS法占據(jù)舉足輕重的地位（見表2）。其中沙坦類、替丁類、二甲雙胍類藥物均有研究者成功實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，可供借鑒。
▲表2-各國(guó)藥物監(jiān)管部門公布的部分LC-MS法
除亞硝胺類雜質(zhì)外，LC-MS法也適用于芳基磺酸酯、芳香胺類雜質(zhì)。孫 春 艷等[21]建立的高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）方法可以同時(shí)測(cè)定吉非替尼中４種芳香胺類基因毒性雜 質(zhì)。駱美玉等[22]建立了不需要前處理的HPLC-MS/MS法對(duì)鹽酸吉西他濱中兩種甲磺酸酯雜質(zhì)—MMS和EMS進(jìn)行了測(cè)定。
LC-MS法在基因毒性雜質(zhì)定量方面通常采用四極桿分析器（MS），但是也有研究者開發(fā)出利用高分辨質(zhì)量分析器（TOF、Orbitrap）分析此類雜質(zhì)的方法：徐文峰等人[16]采用高效液相色譜- 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（LC-Q-TOF-MS）測(cè)定氯沙坦鉀及其復(fù)方制劑中NMBA。另外，F(xiàn)DA還發(fā)布了采用LC-Q-Orbitrap-MS[23]法測(cè)定沙坦類藥物中NMBA 含量。高分辨質(zhì)量分析器以其超高分辨力和靈敏度以及超快分析速度的優(yōu)點(diǎn)，今后也許會(huì)在基因毒性雜質(zhì)定量方面得到越來越多的應(yīng)用。
2.5 離子色譜法（IC）
對(duì)于無機(jī)陰離子和陽離子（如疊氮酸、亞硝酸、溴離子等）和有機(jī)離子（如生物胺、有機(jī)酸、糖類分析等），可以采用 IC 法來檢測(cè)[11]。例如，無法用 GC法檢測(cè)到的磺酸酯類雜質(zhì)可以在堿性條件下水解生成甲磺酸鈉，有研究者利用此化學(xué)性質(zhì)建立了合適的IC 法進(jìn)行分析[24]，IC法能 有 效 提 高 檢 測(cè) 準(zhǔn)確性。也有學(xué)者[25]選擇離子對(duì)試劑四丁基氫氧化銨，建立IC法對(duì)氟達(dá)拉濱藥物中離子形態(tài)的三氟甲磺酸酯類雜質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。因此，對(duì)于易離子化且穩(wěn)定性強(qiáng)的基因毒性雜質(zhì)，IC法是一個(gè)合適的選擇。
三、總結(jié)
自從20 世紀(jì) 80 年代末 至90 年代初以來，研究者們對(duì)基因毒性雜質(zhì)的研究從未止步，被探索出的基因毒性雜質(zhì)種類越來越多。尤其是隨著近年來此類雜質(zhì)不斷地在藥品中被檢出超標(biāo)（如纈沙坦、雷尼替丁、鹽酸二甲雙胍……），未來可能還會(huì)有更多的藥物被檢出此類雜質(zhì)，如此嚴(yán)峻形勢(shì)下，各國(guó)監(jiān)管部門對(duì)此類雜質(zhì)的控制要求也隨之越來越嚴(yán)格……。
對(duì)基因毒性雜質(zhì)的有效控制離不開科學(xué)合理的分析方法。目前在此類雜質(zhì)分析方法開發(fā)方面仍然存在兩大難點(diǎn)：一方面，如何選擇合適的前處理方法，既要盡可能減少雜質(zhì)的損失，又要盡可能減少基質(zhì)污染，從而保證測(cè)試的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度；另一方面，如何建立通用、簡(jiǎn)便、靈敏度和準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好、成本低的定量方法，以保證該方法的適用性。相信隨著研究者們的不斷努力探索，以上兩大難點(diǎn)會(huì)逐步得到破解。
本文匯總了基因毒性雜質(zhì)常用的分析方法，為廣大研究者在此類雜質(zhì)的分析方法開發(fā)和驗(yàn)證方面提供參考，不足之處還望批評(píng)指正！
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