目的：建立某高風險注射劑生產企業制藥用水系統微生物數據庫，為企業制藥用水系統污染微生物的有效控制和溯源調查提供指導。
方法：連續4個季度對某大容量注射劑生產企業的純化水系統和注射用水系統監控收集微生物，采用基于16S rRNA 和ITS rDNA 序列比對等方法鑒定污染微生物，結合微生物種屬和來源信息進行分析，建立企業制藥用水系統的微生物菌庫。
結果：共分離鑒定1499 株細菌和20株真菌，注射用水系統和純化水系統的微生物分別占比9.0%和91.0%。純化水系統中鞘氨醇單胞菌和甲基桿菌最多，分別占全部分離菌的28.9%和25.2%。注射用水系統中葡萄球菌和微球菌較多，分別占全部收集菌的24.9%和18.2%。純化水系統中污染的微生物主要為革蘭氏陰性菌，占污染微生物總數的67.0%。注射用水系統中污染的微生物主要為革蘭氏陽性菌，占污染微生物總數的60.3%。制藥用水系統中較為常見的真菌為雜色曲霉菌和產黃青霉。此外，經分析發現，純化水系統的微生物在第二季度和第三季度數量占比較多，占全年微生物總量67.8%，第一季度和第四季度微生物數量則下降；注射用水系統微生物數量則在第二季度較多，其余3個季節數量差不多。
結論：建立制藥用水系統微生物菌庫可指導制藥用水系統的運行維護及消毒滅菌，同時也為高風險藥品生產企業的微生物污染事件提供溯源調查基礎。
制藥用水是藥品生產過程中使用量最大最廣的一種原料，尤其是注射劑生產企業使用的注射用水，會通過注射直接進入人體，直接影響患者的安全[1]。制藥用水的制備、儲存和分配系統是藥品生產的關鍵系統，《藥品生產質量管理規范》(GMP)規定藥品生產企業應根據監控計劃對制藥用水的微生物負載等指標進行監測，并通過年度質量回顧工作分析制藥用水是否持續處于穩定、受控狀態。隨著新版GMP 的實施，各制藥企業開始關注制藥用水系統的風險控制，尤其是水中微生物的控制。因為水系統中的微生物可浮游或黏附于管道和儲罐的內壁等部位，并能大量繁殖形成生物膜，可以持續釋放微生物從而形成持久的污染源，同時生物膜也是形成內毒素的主要原因[2]。
微生物檢測是評價制藥用水是否合格的重要指標，微生物指標的檢測與控制是一項必要而復雜的工作[3-4]。尤其針對高風險無菌藥品生產企業，通過對制藥用水系統的微生物進行系統科學的收集和分析，采用合適的鑒定手段對制藥用水正常狀態下微生物進行調研，可以幫助生產企業更好地對日常制藥用水系統運行及消殺情況進行評價，也可以進一步指導制藥用水系統的滅菌、消毒和清潔[5-6]。建立的制藥用水系統微生物菌庫也可為基于微生物和藥品特性分析風險等級收集的藥品生產環境菌庫奠定數據基礎，幫助藥品中污染微生物進行溯源調查。
1、材料
1.1儀器
ME2002E 電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；MLS-3781-PC 高壓蒸汽滅菌器(日本三洋公司)；生物安全柜(力康生物醫療科技控股有限公司)；SF450滅菌箱、IF450 恒溫培養箱、ICP55 低溫培養箱均來自德國Memmert；HTY-2000B 型集菌儀、FC502 一次性使用集菌培養器均來自杭州泰林生物技術設備有限公司；ABI3730-XL 測序儀(美國ABI 公司)。
1.2培養基
胰酪大豆胨瓊脂培養基(TSA ， 批號：1064583)、R2A 瓊脂培養基(批號：1061327)均由廣東環凱微生物科技有限公司提供；以上培養基適用性檢查均符合中國藥典2015 年版規定[7]。
2、方法與結果
2.1制藥用水系統微生物的收集
本研究連續4 個季度對某大容量注射劑無菌藥品生產企業純化水的各分配系統總供水點、回水點、使用點和注射用水系統供水點、各車間回水點及使用點進行取樣，按照中國藥典2015 年版純化水標準進行微生物限度檢查。純化水的各分配系統總供水點、回水點每天取樣檢測，各使用點每月取樣檢測；注射用水系統供水點、各車間回水點每天取樣檢測，各使用點每月取樣檢測。
2.2制藥用水系統微生物的分離和保存
一共收集獲得1 499 株細菌和20 株真菌，對收集的微生物進行復蘇分離純化，復蘇培養基采用TSA 和R2A 瓊脂培養基，采用磁珠保存管置−70 ℃冰箱保存。部分無法復蘇的菌株采用直接單個純菌落鑒定。
2.3細菌16S rDNA 全長測序及真菌ITS rDNA 測序鑒定
對制藥用水系統收集獲得的1 499 株細菌及20 株真菌分別采用測序儀進行細菌16S rDNA 和真菌ITS rDNA 測序鑒定。本研究比對的數據庫包含NCBI-Fungi 和NCBI-Bacteria(同源性>98.65%判定為同一種微生物[8])。
2.4制藥用水系統微生物污染分析
本次通過4 個季度連續收集到制藥用水系統微生物菌株共計1 519 株，包括1 499 株細菌和20株真菌。其中132 株細菌來源于注射用水系統，1 367 株細菌來源于純化水系統；4 株真菌來源于注射用水系統，16 株真菌來源于純化水系統。來源于注射用水系統的微生物占比9.0%，來源于純化水系統的微生物占比91.0%。整個制藥用水系統細菌占比98.7%，真菌占比1.3%。結果見表1。
表1 菌株數統計
2.5隨季節微生物污染變化
純化水系統的微生物在第二季度和第三季度數量占比較多，占全年微生物總量67.8%，第一季度和第四季度微生物數量則下降；注射用水系統微生物數量則在第二季度較多，其余三個季節數量都差不多。結果見表1。這可能和溫度、濕度等季節性因素存在關聯。也有報道顯示，在豐水期制藥用水系統管路內檢出革蘭氏陰性菌比例上升，提示在這些時期需注意水系統管路等清潔消毒是否到位。
2.6制藥用水系統微生物菌庫的建立和分析
從制藥用水系統收集的1 519 株微生物的測序鑒定結果統計見表2。純化水系統中鞘氨醇單胞菌和甲基桿菌最多，分別占全部分離菌的28.9%和25.2%；其次為微球菌、短桿菌和叢毛單胞菌，分別占全部收集菌的12.8%，8.0%和7.8%。注射用水系統中葡萄球菌和微球菌較多，分別占全部收集菌的24.9%和18.2%；其次為芽孢桿菌和甲基桿菌，分別占全部分離菌的10.3%和8.8%。本研究通過對4 個季度收集的制藥用水微生物的測序鑒定結果進行整理和分析，初步建立了制藥用水微生物菌庫。
表2 制藥用水系統微生物鑒定結果
對微生物鑒定結果分析總結見表3，純化水系統中污染的微生物主要為革蘭氏陰性菌，占污染微生物總數的67.0%，其中也有芽孢桿菌污染(占比2.0%)。注射用水系統中污染的微生物主要為革蘭氏陽性菌，占污染微生物總數的60.3%，其中芽孢桿菌污染占比10.3%。
表3 制藥用水系統微生物污染結果
本研究從制藥用水系統中一共收集到20 株真菌，污染真菌種群的多樣性分析見圖1。青霉菌是制藥用水系統中主要污染真菌，占比50%，其中最常見的為產黃青霉。其次為雜色曲霉菌，占比20%。注射用水系統中污染的真菌為團青霉和白腐菌。
圖1 制藥用水系統污染真菌種群多樣性分析
3、討論
從建立的制藥用水微生物菌庫各方面的對比情況分析可知，制藥用水系統中微生物占比絕大多數為革蘭氏陰性菌，占比64.2%。其中收集到假單胞菌55 株，假單胞菌屬的微生物容易形成生物膜，易造成水系統的微生物負載超標，對產品和患者安全帶來影響，因此需要在水系統中嚴格控制，可采用熱消毒方式(通常80 ℃)對這類熱敏感微生物進行殺滅。芽孢類微生物占比3%，目前國際上也將芽孢類微生物列為產品中不可接受微生物，因此制藥用水系統中如果出現這類較難消殺的微生物[9]，也需要引起重視。在制藥用水系統中較為常見的真菌為雜色曲霉菌和產黃青霉。從FDA 的Bad Bud Book 致病菌參考手冊可知，曲霉菌屬和青霉菌屬均屬于不可接受微生物范疇，FDA 也曾經因為產品中出現這兩大類微生物把產品進行召回，因此針對水系統出現的這2 類霉菌，需要制定有效的消毒殺菌手段，防止這類微生物形成生物膜，造成更大的危害。
本次研究收集的注射用水系統污染的微生物主要為革蘭氏陽性菌，可能革蘭氏陽性菌細胞壁較厚耐熱性好，比革蘭氏陰性菌更能耐受注射用水系統溫度(70~80 ℃)。而純化水系統污染的微生物主要為革蘭氏陰性菌，因此可根據純化水系統和注射用水系統微生物種類的不同，采取有針對性的控制微生物手段。注射用水系統出現的革蘭氏陽性菌主要考慮少量來源于純化水系統，更多可能是外部環境帶來的污染，因此企業需要重點考察外部環境對注射用水系統的影響，確保注射用水系統的清潔干凈(包括各個取樣點、使用點)，同時應對注射用水系統進行系統檢查，重點檢查維護是否到位、是否存在可能與外部相通的位置。
本研究通過4個季度的持續采樣收集制藥用水微生物，初步建立了高風險藥品生產企業制藥用水系統的微生物菌庫，但是環境微生物庫的建立是個持續動態的過程，因此需要在日常監測中不斷完善[9]。制藥用水系統微生物菌庫的建立，可幫助生產企業更好地評價日常水系統運行情況及消殺效果，并根據菌群建立不同的消殺方案，同時也為高風險藥品生產企業的微生物污染事件提供溯源調查基礎。
參考文獻
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