近日，東華大學洪楓教授團隊利用1,4-丁二醇二縮水甘油醚（BDDE）成功交聯各向異性的細菌納米纖維素（bacterial nanocellulose, BNC）和透明質酸（hyaluronic acid，HA），制備了一種新型復合人工角膜。通過考察不同濃度HA交聯的BNC/HA復合膜的透光率、力學性能、保水能力和細胞相容性等性能的變化，評價了該BNC/HA復合膜在人工角膜移植中的應用潛力。值得注意的是，這是首次將具有各向異性力學性能的BNC應用于人工角膜。該成果以Preparation and Evaluation of Bacterial Nanocellulose/Hyaluronic Acid Composite Artificial Cornea for Application of Corneal Transplantation為題，作為2023年度1月首頁封面文章（圖1）發表于美國化學學會的Biomacromolecules上（DOI：10.1021/acs.biomac.2c01052）。
圖 1 文章封面圖
角膜是眼球最外層的透明組織，它幫助聚焦光線，保護眼睛的組織和結構。同種異體角膜移植是治療角膜疾病的首選，但全球眼庫資源嚴重短缺，全球尤其是發展中國家供不應求。
BNC除了常見的優異理化性質外，還具有一定的柔韌性和透明性，這使得其在角膜移植方面具有巨大潛力；同時BNC的形狀可控，具有一定的順應性，該順應性可以使BNC很好地貼附于眼表，適應眼表的圓頂型形狀。該課題組前期通過研究，自主開發的一款水平轉鼓生物反應器（中國專利ZL201210014383.9）不僅極大地提高了BNC的生產效率，而且與傳統的淺盤靜態發酵技術相比，該轉鼓動態發酵生產的BNC具有各向異性的力學性能和更高的透光率（Carbohydrate Polymers, 2019, DOI:10.1016/j.carbpol.2019.01.072)。然而，由于BNC在動態發酵過程中受到剪切力的影響，致使其網絡疏松、力學性能較差；而且與天然角膜相比，其透明度也沒有100%滿足要求，因此現有BNC的性能尚不足以在人工角膜移植中應用。
HA具有優異的透明度、潤滑性和保濕性，但其力學性能較差，體內易降解。為了解決HA存在的問題，一般使用化學交聯延長HA在體內的壽命。BDDE具有優良的穩定性和在醫療器械中長達15年的安全使用記錄，其交聯原理是在弱堿性條件下，分子兩端的環氧基優先與HA主鏈中最容易接近的伯醇反應，從而將HA分子鏈以醚鍵相連（交聯反應示意見圖2）。最近的研究表明將BNC和HA以BDDE交聯后的復合膜在傷口護理方面具有巨大潛力。然而，經BDDE交聯的BNC/HA復合膜尚未研究透明性和角膜細胞的相容性，也尚未開發作為人工角膜，其在眼部應用的可行性未知。
針對上述問題，東華大學洪楓教授課題組利用水平轉鼓生物反應器獲得各向異性力學性能的BNC后，嘗試不同濃度的HA，通過BDDE將BNC與HA進行化學交聯，從而獲得了BNC/HA復合膜（制備流程見圖3）。
圖 2 復合人工角膜的交聯反應示意圖
圖 3 復合人工角膜制備流程圖
該研究結果表明，在保證BNC三維納米網絡結構不變的情況下，HA的引入增加了納米纖維的直徑，膜表面孔隙變小（圖4）；HA的引入也使BNC的透光率最大提高了40%，肉眼可清晰看到膜底部放置的東華大學彩色校徽（圖5）；在BDDE的作用下，BNC−BNC、BNC−HA和HA−HA在復合膜中發生相互作用。醚鍵的存在使復合膜的最大拉伸強度在轉鼓旋轉方向和軸向上分別提高了2.1倍和2.7倍，復合膜的爆破壓也有一定程度的提高（圖6），同時復合人工角膜還具備一定的抗縫合性（圖7），縫合最大力接近人羊膜的縫合力（0.11 N），這些性能在保持了轉鼓生產的BNC的各向異性前提下進一步滿足了臨床對人工角膜的力學要求。對復合膜進行含水量和失水率測試，結果表明所有復合膜在保持高含水的狀態下保水性能明顯提高（表1和圖8），這表明其能滿足角膜在眼表的濕潤要求。體外培養兔角膜基質細胞（RCSCs）的結果表明，所有樣品均能支持RCSCs在其表面的黏附和增殖，細胞形態正常，材料具有良好的細胞相容性（圖9）。以上結果均顯示所制備的人工角膜不僅安全，而且能夠滿足臨床對人工角膜的要求。
綜上，采用水平轉鼓反應器制備的各向異性BNC交聯HA獲得的復合膜，具有人工角膜應用的巨大潛力，其優異的光學性能和保濕性能滿足眼科材料的基本物理化學性質。此外，從水平轉鼓生物反應器中獲得的新型BNC由于具有高透明度，未來還可以與具有抗菌能力的聚合物材料復合，從而制備一種適合于眼表修復的眼表敷料。利用轉鼓反應器制備的新型BNC在眼科領域有著很好的應用前景，在角膜移植或眼表修復方面均具有很大的潛力。
圖 4 不同濃度HA制備的BNC/HA復合膜的微觀形態和纖維直徑分布統計
圖 5 不同濃度HA制備的BNC/HA復合膜的光學性能（圖中東華大學LOGO的使用已獲得學校代表批準）
（A）BNC/HA復合膜的透明度差異；（B）BNC/HA復合膜透光率。
圖 6 不同濃度的HA制備的BNC/HA復合膜的力學性能
（A）拉伸強度；（B）斷裂伸長率；（C）旋轉方向的應力−應變曲線；（D）軸向的應力−應變曲線；（E）爆破壓
圖 7 不同濃度的HA制備的BNC/HA復合膜的縫合強度
（*：0.01 < P < 0.05，**：0.001 < P < 0.01，***：P < 0.001。單個直方圖上方的*表示與BNC在同一方向上的顯著性差異）
表1 不同濃度的HA制備的BNC/HA復合膜的含水量
圖 8不同濃度的HA制備的BNC/HA復合膜的失水率
圖 9 不同濃度HA的BNC和BNC/HA復合膜中RCSCs的細胞相容性
（A）CCK-8；（B）細胞存活率；（C）生長在BNC和BNC/HA復合膜表面的RCSCs在培養1、3和5天后的熒光顯微形態；（D）RCSCs在BNC和BNC/HA復合膜上培養1、3和5天后的FE-SEM圖像 （*：0.01<P<0.05，**：0.001<P<0.01，***：P<0.001，#：P>0.05）
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