當(dāng)分離酸性或堿性樣品時(shí)，通常需加入一定量的緩沖鹽，緩沖鹽的濃度及類型如何確定？

1、緩沖鹽的濃度

緩沖鹽的濃度對(duì)離子樣品保留值的影響通常較小，濃度一般為10-50mmol/l。

2、緩沖鹽的類型

緩沖鹽類型的選擇，主要取決于所需要的緩沖能力，在反向色譜中，流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開(kāi)發(fā)對(duì)條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對(duì)于離子型化合物，典型的樣品的保留隨pH改變而明顯變化。通常在pH2到4條件下，保留時(shí)間對(duì)pH的微小改變穩(wěn)定性最高。因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開(kāi)發(fā)的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。緩沖鹽溶液的pH值越接近其pka，緩沖能力越強(qiáng)。一般緩沖鹽溶液的pH值應(yīng)在其pka±1的范圍內(nèi)。

3、緩沖鹽的離子締合（反離子對(duì)液相色譜行為的影響與理論解析）

如酸性條件下分離堿性化合物，加入NH4CL，堿性物質(zhì)離子與反離子相互作用的平衡導(dǎo)致它們相互的溶劑化并形成相關(guān)復(fù)合物離子：

[堿]+[Cl]− = [堿+ -- Cl−]，在低pH時(shí)，堿性化合物被完成質(zhì)子化，溶液陰離子（如CL-）在流動(dòng)相中破壞了堿性物周圍的水分子并增加其疏水性，導(dǎo)致樣品保留時(shí)間增加，當(dāng)鹽濃度大于50mM時(shí)，保留時(shí)間略有下降[4]，這可能是飽和反離子CI-引起的離子相互作用的屏蔽作用。此外還可以添加硫酸鈉或者高氯酸鈉等改變堿性化合物的保留。

4.緩沖鹽的其它性質(zhì)

緩沖鹽的溶解性、揮發(fā)性和穩(wěn)定性（可能與設(shè)備、樣品和或色譜柱發(fā)生作用）對(duì)某些分離也很重要。如磷酸鹽，在含有高濃度有機(jī)相（70%以上），可能會(huì)析出；一些緩沖劑放置即降解，貯存或長(zhǎng)期使用后其紫外吸收會(huì)增加（如：TFA、三乙胺）；一些緩沖鹽能通過(guò)形成離子對(duì)，對(duì)樣品發(fā)生作用（如三氟醋酸緩沖劑與陽(yáng)離子樣品，三乙胺與陰離子樣品等）；揮發(fā)性的緩沖鹽如碳酸胺、甲酸銨、醋酸銨等可應(yīng)用于蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜的檢測(cè)。

5.pH的選擇

通常進(jìn)行分析方法開(kāi)發(fā)時(shí)要求遠(yuǎn)離化合物的pKa，是遠(yuǎn)離主成分的pKa還是遠(yuǎn)離待測(cè)雜質(zhì)的pKa？如果在pKa附件是否方法就不能用？

是各雜質(zhì)的pKa，只不過(guò)平時(shí)經(jīng)常是通過(guò)主成分的pKa來(lái)代表各雜質(zhì)，制定遠(yuǎn)離pKa±2。pKa為化合物的酸堿平衡常數(shù)，即在該pH條件下，該化合物處于分子離子狀態(tài)，分子狀態(tài)化合物，疏水性較強(qiáng)，即色譜柱保留時(shí)間較長(zhǎng)；離子狀態(tài)化合物親水性較強(qiáng)，及色譜柱保留時(shí)間較短。制定的流動(dòng)相pH在待測(cè)組分pKa±2以內(nèi)，有時(shí)也是可用的，只不過(guò)可能存在各雜質(zhì)的色譜行為對(duì)pH較敏感，尤其是保留時(shí)間。會(huì)不會(huì)出現(xiàn)裂縫或出現(xiàn)雙峰的現(xiàn)象，個(gè)人認(rèn)為通常不會(huì)，因?yàn)榉肿与x子間也存在相互作用力，除非分子疏水作用、離子的親水作用大于分子離子間的作用力，才有可能裂縫/出雙峰。