近期，南開大學生命科學學院/藥物化學生物學國家重點實驗室趙強教授與Adam C. Midgley副教授在科愛出版創辦的期刊Bioactive Materials上聯合發表題為“Anti-Sca-1 antibody-functionalized vascular grafts improve vascular regeneration via selective capture of endogenous vascular stem/ progenitor cells”的研究論文。該研究利用血管干/祖細胞特異性標志物Sca-1抗體對靜電紡絲技術制備的聚己內酯人工血管進行功能化修飾。功能化人工血管在植入體內后可以通過選擇性捕捉內源性血管干/祖細胞促進血管組織再生。

01  研究內容簡介

心血管疾病（CVD）因其高發病率和致死率，已成為全球范圍內的重大公共衛生問題。近年來，由合成可降解材料制備的小口徑（< 6 mm）人工血管因其具有良好的生物相容性和力學性能受到了廣泛關注。然而，由于合成材料缺乏抗凝血活性和誘導組織再生的功能，血管植入體內后常發生血栓和內膜增生等問題，導致血管再狹窄。因此，構建具有誘導組織再生功能的活性生物材料是解決人工血管再狹窄問題并實現其臨床轉化的有效途徑之一。

血管干/祖細胞（Stem/progenitor cell, SPC）具有自我更新和多向分化潛能，在維持血管穩態和調控血管重構中發揮重要作用。研究表明，SPC可以在體內和體外條件下分化為血管細胞，包括血管內皮細胞（EC）和平滑肌細胞（SMC），是血管組織修復再生的重要細胞來源。

該研究首先利用靜電紡絲技術制備了聚己內酯（PCL）人工血管。然后，通過生物素-親和素（Biotin-Avidin）反應將Sca-1抗體修飾到PCL人工血管表面（圖1A），獲得了一種Sca-1抗體功能化修飾的人工血管（PCL-Sca-1 Ab）。在材料的制備和表征方面，該研究首先通過掃描電子顯微鏡（SEM）和激光共聚焦成像（CLSM）考察了PCL-Sca-1 Ab人工血管的微觀結構和表面形態（圖1B和C）。其次，力學測試顯示了抗體修飾前后兩種人工血管的力學強度和爆破壓均能滿足體內移植的要求（圖1D和F）。此外，表面功能化修飾提高了人工血管的親水性（圖1E），降低血小板和纖維蛋白原的粘附，從而改善人工血管的血液相容性（圖1G和H）。

圖1 Sca-1抗體功能化修飾的人工血管的制備與表征

為了考察Sca-1抗體功能化修飾后的人工血管對Sca-1+的血管干/祖細胞（Sca-1+ SPCs）的作用，研究人員首先從大鼠的血管外膜中分離出Sca-1+ SPCs。然后，在靜態培養的條件下比較了Sca-1抗體功能化修飾前后人工血管對Sca-1+ SPCs的粘附情況。此外，還利用3D流動培養生物反應器在模擬生理條件下比較了PCL和PCL-Sca-1 Ab人工血管對Sca-1+ SPCs的捕捉以及細胞在血管的駐留情況。結果表明，無論是在靜態還是流動培養條件下，Sca-1抗體功能化修飾均顯著改善了人工血管對Sca-1+ SPCs細胞的粘附和捕捉（圖2）。

圖2 體外細胞粘附和捕捉實驗

將PCL和PCL-Sca-1 Ab兩組人工血管分別移植到大鼠腹主動脈來比較兩組人工血管的體內組織再生情況（圖3）。在移植后的2周和4周時取材分析，通過H&E、番紅O、Masson和VVG染色來分別考察人工血管植入后組織再生和細胞外基質（ECM）的分泌。染色結果顯示，相比于PCL對照組，PCL-Sca-1 Ab的組織再生更好，而且人工血管的管壁中分布著更多的膠原和糖胺聚糖。

圖3 人工血管體內移植后的組織再生情況

血管內皮為防止血栓形成和再狹窄提供了良好的天然屏障，是維持人工血管長期通暢的重要保障。因此，人工血管植入后的內皮化程度是反映血管組織再生的一個重要指標。在該研究中，研究人員通過SEM和En face免疫熒光染色觀察人工血管表面的內皮覆蓋情況。結果顯示，PCL-Sca-1 Ab人工血管的內皮覆蓋率顯著高于對照組，且再生的ECs呈鵝卵石樣形態，并沿血流方向規則排列，與天然動脈相似（圖4）。

圖4 人工血管體內移植后的內皮再生情況

血管平滑肌層在維持血管的力學強度、調節血管的舒張收縮功能等方面發揮著重要作用。因此，研究人員分別用α-SMA和SM-MHC免疫熒光染色對再生平滑肌的表型進行了考察（圖5）。α-SMA+的免疫熒光照片顯示，2周時PCL-Sca-1 Ab組可觀察到均勻分布的α-SMA+細胞，4周時細胞排列更為緊密。而PCL人工血管，2周時，α-SMA+細胞的再生有限，4周時，α-SMA+細胞數量有所增加（圖5A）。SM-MHC+平滑肌再生表現出類似的趨勢（圖5C）。

圖5 人工血管體內移植后的平滑肌再生情況

體外實驗結果顯示Sca-1抗體功能化修飾提高了人工血管對Sca-1+ SPCs的粘附和捕獲。進一步，研究人員在大鼠腹主動脈移植模型中深入研究了Sca-1+ SPCs的體內浸潤情況（圖6）。結果顯示，在植入2周和4周后，PCL-Sca-1 Ab人工血管中Sca-1+ SPCs細胞的數量顯著高于對照組。這些Sca-1+ SPC可進一步分化成為EC和SMC細胞，促進血管組織再生。

圖6 人工血管體內移植后的Sca-1+ SPCs的浸潤和分化情況

接下來，研究人員利用Sca-1 2A-CreER; Rosa-RFP遺傳譜系示蹤小鼠并構建了骨髓移植模型（BMT）來考察參與血管組織再生的SPCs的來源和命運（圖7）。

圖7 利用骨髓移植模型并結合遺傳譜系示蹤小鼠揭示參與血管組織再生的Sca-1+ SPCs的來源和命運

在BMT小鼠頸動脈移植模型中，研究人員發現參與血管組織再生的Sca-1+ SPCs大部分來自血管外周組織，也有少量來自骨髓/外周血（圖7I）。這些募集的Sca-1+ SPCs會進一步的向ECs和SMCs分化來參與血管組織再生（圖7K）。

綜上，該研究設計制備了一種Sca-1抗體功能化修飾的人工血管，其能夠捕捉內源性血管干/祖細胞，有效改善血管組織再生。同時利用遺傳譜系示蹤小鼠并結合骨髓移植模型，進一步考察了參與血管再生的干/祖細胞來源和分化情況。該研究成果不僅為功能型小口徑人工血管制備提供了新的策略，而且為血管干細胞和組織再生機制研究提供了有力的支撐。