如化合物存在酮式烯醇式互變現象，在進行HPLC方法開發時則很可能出現同一化合物有兩個響應接近的峰，或者是一個主峰伴隨一個較大的未知峰，特別是后一種情況，如果把酮式烯醇式互變產生的未知峰當成雜質峰，卻無論如何也精制不掉，造成錯誤的判斷，甚至嚴重影響研究進度。由于酮式烯醇式互變現象在藥物合成及其他研究環節屬于較為常見的情況，故有必要對此進行說明和探討。

一、概念解析

醛、酮分子中由于羰基的影響，α-H變得活潑，具有酸性，所以帶有α-H的醛、酮具有互變異構的性質。在溶液中有α-H的醛、酮是以酮式和烯醇式互變平衡而存在的。如下圖所示：

有兩類結構式在藥物領域非常常見：

    1）β-二羰基化合物，如乙酰丙酮及其衍生物，由于其具有活潑的α-H，經常出現在藥物合成的起始物料和中間體中。

    2）苯酚衍生物或類似結構，如頭孢羥氨芐，也屬于極為常見的情況。

二、互變異構體的差異

以乙酰丙酮為例，酮式狀態為獨立的兩個碳氧雙鍵，而烯醇式狀態則形成共軛雙鍵。烯醇式的最大吸收波長相對酮式向長波長移動，且吸光度增加。酮式狀態沒有親水基團，極性非常小，而烯醇式狀態有羥基，極性較大。

上述內容說明酮式與烯醇式在物理性質和化學性質都可能存在差異，在HPLC上的表現就是烯醇式在反相色譜中保留較弱，出峰較早，且光譜圖、響應值均有可能不同于酮式。

三、影響因素

1.溶劑極性

以乙酰乙酸乙酯為例，實驗測得,在不同極性溶劑中乙酰乙酸乙酯的烯醇式含量有所差異[1]。表1 中列出18 ℃時,在不同極性溶劑的稀溶液中乙酰乙酸乙酯的烯醇式異構體的含量。

數據表明,溶劑介質的極性越強,其烯醇式含量越少。為什么有如此現象呢?乙酰乙酸乙酯分子重排后,形成的烯醇式結構存在分子內氫鍵,構成環狀結構,穩定性增加,因此在非極性溶劑中烯醇式結構的含量較大;而在極性介質中特別是含活潑氫的極性介質中,其活潑氫與酮式結構的羰基氧易于形成分子間氫鍵 ,比亞甲基上的氫競爭羰基氧形成氫鍵的能力強, 導致分子內氫鍵形成能力較小,從而使亞甲基上的氫重排能力 減弱,因而,互變平衡有利于向酮式方向移動,使其烯醇式結構明顯減少。

2.pH

由于烯醇式羥基上氫具有酸性，在高pH值下互變平衡向烯醇式偏移，因此酮式烯醇式互變異構隨著pH的升高，烯醇式比例增加。

3.時間

以對羥基苯丙酮酸為例，其水溶液在室溫（約20℃）放置9小時以上，其互變異構逐漸趨于平衡，此時水溶液中烯醇式的比例為17% [2]。

4.溫度

隨著溫度的升高, 烯醇含量降低。這是因為溫度的升高, 分子的振動加劇, 烯醇形成分子內氫鍵的能力減弱[3]。

5.取代基

因α-H具有酸性，故醛、酮具有互變異構的性質，由此可推導出以下結論：1）一般情況下，如α-H附近有吸電子基團，α-H酸性增強，則互變平衡狀態烯醇式比例增加；2）一般情況下，如α-H附近有給電子基團，α-H酸性減弱，則互變平衡狀態烯醇式比例減少。下圖中數據可以看出丙酮中烯醇式/酮式的比值為2.5ppm,乙酰丙酮該值為3.6，苯酚則絕大部分為烯醇式結構。

如α位附近取代基體積較大，具有立體障礙則不利于形成六元環的烯醇式結構。

四、HPLC方法開發

1.初步評估

根據以上信息，在進行酮式烯醇式互變異構化合物的HPLC方法開發時，首先應根據化合物結構式初步評估在預定色譜條件下的酮式烯醇式互變的趨勢。例如某個中間體為三氟乙酰丙酮衍生物，根據上文論述的規律，應能初步判斷在反相色譜條件下，互變異構主要以烯醇式為主。為了獲得單一的烯醇式峰，可以嘗試加大流動性緩沖液pH,促進烯醇式的羥基電離，使互變向烯醇式移動，如選擇pH7.0磷酸鹽緩沖液。

如評估認為是酮式為主，可以嘗試增大流動性極性，即減少有機相初始比例，使互變向酮式方向移動。也可以升高柱溫，以獲得單一色譜峰。

2.注意事項

由于互變異構可能需要時間，某些情況下可能需要研究供試品處理方法，如稀釋劑與供試品溶液的放置時間。

如果供試品在稀釋劑和流動性中的酮式與烯醇式比例相差太大，可能會造成溶劑效應，表現出色譜行為異常。

如果供試品固體狀態和溶液狀態酮式與烯醇式比例相差較大，且互變平衡較慢，可能供試品溶液需要研究互變平衡的時間。

五、案例分析

1. β-二羰基化合物

β-二羰基化合物由于常見于起始物料和中間體中，出于保密的需要，不便用具體的實例說明，請讀者諒解。可以透露的是，一般該類化合物都具有極其活潑的α-H，互變平衡中主要以烯醇式為主……

2.苯酚衍生物

以頭孢羥氨芐為例，2015年版中國藥典中收載的頭孢羥氨芐原料藥有關物質檢測方法流動相A為：流動相A 為0. 02mol/L磷酸二氫鉀溶液（取磷酸二氫鉀2. 72g，加水8 0 0m l使溶解，用lm o l / L 氫氧化鉀溶液調節pH值至5. 0，用水稀釋至1000ml，混勻）。

流動相A用磷酸鹽緩沖液，pH值為5. 0，而不是常見的3.0（題外話：磷酸鹽在pH5.0沒有緩沖能力，滿滿的槽點）。本人雖然沒有經歷過頭孢羥氨芐的研究工作，但也能推測，如果流動相A是pH3.0就會存在酮式異構體，在主峰后面出峰，所以需要提高流動相pH，使互變異構向烯醇式移動。頭孢羥氨芐結構式見下圖，酮式烯醇式互變異構發生在左邊酚羥基上：