關鍵詞

3D類器官，類器官血管化，腫瘤和免疫環境的相互作用，類器官系統構建，疾病模型，新藥篩選，藥物毒理，干細胞與再生醫學

提到類器官，許多研究人員腦海中浮現的關鍵詞便是：前沿、高級、好發文章等。

作為當下最為火熱的研究方向之一，類器官為廣大研究人員在體外真實模擬體內器官發育、疾病機制研究、靶點藥物開發提供了便利。其具有的諸多優點已經被各類文章相繼報道。

盡管近10年來類器官研究如火如荼，各種類器官相繼被開發出來。但是，缺乏血管化結構、缺乏免疫細胞、器官系統化程度低等問題限制了類器官研究的進一步發展。

今天，我們就從最新的研究文獻入手，逐步破局類器官研究的“三大挑戰”。

血管化

在所有的類器官研究中，腦類器官應該是最為特殊的，不僅因為其臨床樣本的珍貴性，還得益于其重要的臨床價值。然而，長久以來，腦類器官的發展并不順利，這其中最主要的障礙在于腦類器官系統缺乏體內腦組織的微環境、神經元回路、血管和免疫系統。

尤其是血管，其對于腦組織的營養供應和神經細胞分化都發揮著促進作用。血管的缺乏導致腦類器官中心壞死，進一步干擾其正常發育和神經元遷移路線。盡管與血管干細胞的共培養為上述問題提供了一定解決方案，但營養供應和真實血液微環境的問題仍然存在。

2019年，來自耶魯大學的研究團隊在國際頂刊Nature Methods在線發表了題為《Engineering of human brain organoids with a functional vascular-like system》的研究性論文。文中使用表達人類 ETS 變體 2 ( ETV2 )的人類胚胎干細胞 (hESCs)成功構建了具有血管樣結構的腦皮質類器官(hCOs)，該類器官具有類血腦屏障結構，包括緊密連接、營養轉運蛋白和跨內皮電阻的表達增加，填補了腦類器官缺失血管的問題，豐富了腦類器官的研究應用。

ETV2轉錄因子是機體發育時期內皮細胞分化的關鍵基因。在這項研究中， 研究人員使用含有賽默飛Gibco B-27添加劑的培養基中，添加ETV2誘導產生了腦皮質類器官 (hCOs)，并通過改變了ETV2的比例（5%、10% 和 20%）和誘導時間，確定了在 hCOs 中形成血管樣結構的最佳條件：20% ETV2，18天誘導。通過免疫熒光，研究人員在該條件下可以顯著觀察到hCOs高表達的EC 標記CDH5、CD31、KDR、TEK、vWF和CD34。同時研究人員將具有血管樣結構的 hCOs 命名為 vhCO。

Fig.1 Characterization of vasculature-like structures in vhCOs.

為了評估vhCO的血管樣結構是否具有相應的功能，研究人員又分別在30、70 和 120 天評估了心室 (VZ) 樣區、心室下 (SVZ) 樣區和皮質層的分化情況。免疫熒光結果顯示hCOs 和 vhCOs 在管腔周圍都表現出高表達 SOX2的VZ 和 TBR1的SVZ。這些結果表明 hCOs 和 vhCOs 分化程度相似，都具有大腦皮層結構的區域和形態特征。

同時，使用CD31分子的整體免疫熒光染色，研究人員對內皮和血管樣網絡的組織也進行了評估。結果發現在30天時，vhCOs具有血管樣結構，而hCOs則沒有。在70天時， vhCOs中形成更加復雜的血管樣結構網絡。這些結果表明了ETV2可以成功誘導的血管樣結構類器官的產生。

Fig.2 vhCOs demonstrate BBB characteristics.

結構和功能是相輔相成的兩個有機組成。在分析了vhCOs中血管樣結構的形成后，研究人員又對其功能進行了評估。

首先通過灌注FITC-葡聚糖，研究人員確定了vhCOs中血管具有可灌注的功能。其次，通過對hCOs 和 vhCOs生長情況的對比，研究人員發現vhCOs中血管具有運送氧氣的功能。最后，通過對分化神經元的分析，研究人員確定了表明 vhCOs中的血管樣結構對于神經元成熟起著關鍵作用。

Fig.3 Single-cell analysis of vhCOs.

進一步地，通過單細胞測序，研究人證明了ETV2對 vhCO 中的血管 EC成熟和血管形態發生至關重要。同時，與發育中的人類大腦 (GW08-23) 的單細胞轉錄組譜進行比較后，研究人員證明了vhCOs 衍生的神經元類對應妊娠期16-19 周的神經元發育，進一步證明其向內皮譜系分化的潛力。

總的來說，這項研究通過結合轉錄因子ETV2與腦類器官，首次構建了具有血管樣網絡結構及類血腦屏障結構的腦類器官，為解決腦類器官乃至其他類器官培養過程中缺失血管這一關鍵問題提供了對策，推動了類器官研究的發展。

免疫化

免疫治療的興起極大推動了腫瘤研究的發展，然而由于種屬特異性、人源化體系的復雜性、免疫系統的部分或無效重組建等問題，致使免疫腫瘤模型面臨著巨大的挑戰，臨床上迫切需要能夠用于個體化驗證療效的體外模型。類器官的出現給腫瘤免疫治療提供了新的契機，然而，現有的類器官中缺乏免疫細胞限制了其發展。

一項發表于頂刊Cell題為《Generation of Tumor-Reactive T Cells by Co-culture of Peripheral Blood Lymphocytes and Tumor Organoids》的研究性論文為這個問題的解決提供了新的策略。

Fig.4 Co-culture of epithelial tumor organoids and peripheral blood lymphocytes

在這項研究中，研究人員通過來自患者的自體腫瘤類器官和外周血淋巴細胞共培養建立一個能夠特異性誘導分析腫瘤免疫反應的平臺，為分離評估腫瘤免疫中T細胞提供了新的方法。

Fig.5 Characterization of a Panel of dMMR CRC Organoids

首先，研究人員從13 名錯配修復基因缺陷型(dMMR)結直腸癌患者（dMMR CRC）體內分離15 個腫瘤類器官，成功率為60%，并使用含有賽默飛Gibco B-27添加劑的培養基按照1:2 至 1:5進行傳代培養。隨后，研究人員對著15個腫瘤類器官的特點進行了分析。通過全外顯子組測序 (WES)、免疫組織化學染色分析發現MHC-1類分子的缺失不是類器官的一般特征。

Fig.6 Induction of Tumor Reactivity in Circulating T Cells by Co-culture with Autologous Tumor Organoids

進一步地，為了評估該腫瘤類器官是否可用于獲得腫瘤特異性 T 細胞。研究人員構建了“腫瘤類器官-外周血淋巴細胞”共培養模型。其中，外周血單個核細胞(PBMC) 從 dMMR CRC 患者中分離出來，并每周使用自體腫瘤類器官刺激。通過對CD8+ T 細胞效應分子 IFNγ 和CD107a進行染色分析，在共培養 2 周后評估CD8 + T 細胞對腫瘤的識別情況。

結果表明在 8個MHC-1 陽性腫瘤類器官中，有 4 個（50%）在共培養 2 周后，IFNγ 和CD107a發生了上調。而在MHC I 類缺陷類器官中沒有發生上調，并且與類器官刺激前相比，CD8+ T 細胞群增加了10倍。這些結果表明了該系統可以用于產生評估腫瘤特異性 T細胞亞群。

Fig.7 Induction of Tumor Reactivity in Circulating T Cells from Patients with NSCLC

進一步地，研究人員又使用非小細胞肺癌對該系統的廣譜性進行了分析。通過前述類似的方法，研究人員在培養兩周后也觀察到了CD8+ T 細胞群進行了擴大。

綜上，這些結果表明：通過腫瘤類器官與免疫細胞共培養可以有效誘導腫瘤特異性T細胞的產生。這一研究也極大拓展了類器官在腫瘤免疫中的應用，為解決類器官免疫細胞缺失問題提供了新的策略。

系統化

許多疾病的發生都是多器官系統共同作用完成的，而傳統的單個類器官雖然能夠較為真實的模擬體內單個器官的環境，但是對于多系統發生的疾病，仍然存在一定的缺陷。因此，構建多系統協同作用的類器官就成為解決這個問題的一個研究方向。

2021年11月，一項發表于著名期刊ADVANCED SCIENCE的研究《Microengineered Multi-Organoid System from hiPSCs to Recapitulate Human Liver-Islet Axis in Normal and Type 2 Diabetes》中，就通過構建肝臟和胰島類器官共培養構建了2型糖尿病（T2DM）疾病模型，這種多類器官系統可以在生理和病理條件下體外模擬肝胰島軸，為今后 T2DM 發病機制研究和藥物開發提供了獨特的研究平臺。

Fig.8 Schematic of hiPSCs derived multi-organoid-on-chip system to model human liver-pancreatic islet axis in vitro.

2型糖尿病（T2DM）的發病率逐年攀升，并且治療費用昂貴，極大加重了社會的疾病負擔。T2DM 的特點是高血糖和胰島素抵抗，通常伴有胰腺β細胞功能障礙和肝臟中的胰島素抵抗。肝臟和胰島在維持血糖正常方面表現出雙重功能，兩者的功能紊亂導致了T2DM的發生。

目前研究葡萄糖代謝和 T2DM依賴于動物模型，或使用原代動物肝細胞和胰島β細胞或其細胞系的混合物。但是，這些模型不能準確模擬人類生理功能和代謝反應，尤其各個不同器官間的相互作用。類器官的出現給解決上述問題帶來了轉機。

在這項研究中，研究人員開發了一種微流控多類器官系統，用于研究人類肝胰島軸在正常和疾病環境中的胰島素和葡萄糖調節。

為了模擬體內肝臟和胰島之間的葡萄糖調節，研究人員構建了一套微流控控制的多類器官系統，包括類器官共培養芯片、蠕動泵和灌注裝置。微流控芯片由平行微通道網絡連接的兩個隔室組成。每個隔室都包含一系列微孔，以維持肝臟和胰島類器官的 3D 培養。相互連接的微通道促進了兩種類器官之間的介質交換和分泌代謝產物，由此實現了肝臟和胰島類器官的共培養。

其中，肝臟和胰島類器官是通過微孔陣列中 hiPSCs 的產生的，并使用含有賽默飛Gibco B-27添加劑的培養基進行培養，最終在微孔中形成了具有均勻尺寸和形態（直徑 200 µm）的擬胚體 (EB)。

此外，通過向培養基中添加特定的生長因子和小分子，EB 分化為內胚層細胞，并分別在第 20 天和第 23 天分化為肝臟或胰腺譜系。隨后，將肝臟和胰島類器官轉移到芯片裝置中進行長期共培養。

Fig.9 Identification of organ-specific protein and gene expressions in liver and islet organoids prior to co-culture assay.

在共培養系統構建完成后，研究人員在第 0、5、11、20 和 23 天分別觀察肝臟和胰島類器官的形態和大小分布。結果表明在培養誘導分化過程中，肝臟和胰島類器官的平均大小逐漸增加，形態保持良好。此外，通過活流式細胞術檢測細胞活力后發現99.03%的肝臟類器官和96.11%的胰島類器官細胞保持了良好的細胞活力。

為了進一步驗證該共培養類器官的功能，研究人員在第 20 天使用免疫熒光和實時聚合酶鏈反應 (RT-PCR) 鑒定了肝臟特異性細胞類型和蛋白質分泌。結果表明，hiPSC 誘導分化的肝類器官具有代謝藥物的能力并含有天然肝臟的關鍵細胞成分。同樣，通過免疫組織化學分析和 RT-PCR 證實了 hiPSC 誘導分化的胰島類器官是含有四種類型 ECs 的典型多細胞組織。

Fig.10 Comparison of cell viability and functionality of liver and islet organoids under mono- and co-culture conditions.

同時，研究人員又對該共培養類器官系統進行了長達30天的功能研究。與單獨的類器官培養相比，共培養系統中類器官在長期培養過程中表現出了更高的細胞活力，并顯著提高了胰島類器官的存活率和胰島素分泌功能。

綜上，這項研究構建的多類器官芯片系統為研究多器官疾病發生提供了新的研究策略，并填補了單個類器官無法模擬多系統相互作用的空白。同時，這項研究也讓我們看到了結合不同的技術手段豐富類器官培養的可能發展方向。

總結

總的來說，對于火熱了10年的類器官研究來說，其存在的“血管化、免疫化、系統化”三大問題近年來已有不同研究團隊提出了不同的解決方案。雖然這些研究方案尚不圓滿，但是讓我們看到類器官研究上的更多可能。

盡管類器官研究仍有諸多問題需要解決，但是全球范圍內不斷的學術突破也讓我們看到這些問題終將被一步步解決。而無論采用什么樣的解決方案，研究人員都需要高質量的試劑支持。