隆抗體 (mAb) 和重組蛋白的連續工藝已被證明可以提高某些單元操作的生產力，例如細胞培養和捕獲層析。這對于對工藝條件敏感的不穩定產品特別有利。它有可能提高工藝一致性和產品質量以及產量，減少工藝時間，消除其它低附加值的活動，并有助于降低生產成本。

鑒于這些好處，連續工藝可能會解決病毒載體生產中出現的效率低下以及收率低的問題。病毒的特性和瞬時轉染的性質使轉向連續操作成為一項挑戰。因此，重點更多的是工藝強化，而不是連續工藝本身。

病毒載體的批次工藝具有挑戰性

病毒載體的批次生產主要是通過使用多個質粒瞬時轉染人胚腎(HEK) 293 細胞來實現的。這個過程通常會受到低滴度的影響。貼壁細胞培養是最常見的，但目前正在轉向基于懸浮的工藝，不過與重組蛋白和mAb 工藝中觀察到的結果相比，細胞密度非常低。

盡管腺相關病毒 (AAV) 比慢病毒 (LV) 更穩定，但對于AAV 載體，轉染步驟會導致大量“空”或“部分”病毒衣殼的產生，這些衣殼不包含完整的目標基因。與此同時，LV載體易受機械應力以及 pH 值和溫度變化的影響而降解。這些因素導致下游純化工藝中的低回收率。

從抗體的連續工藝中學習

Polyplus-transfection 的科學支持經理 Guillaume Freund 對此表示，蛋白質的生產比病毒載體的生產更容易，因為載體產品的復雜性更高，其中涉及多種蛋白質，這些蛋白質包含在一個復雜的三維結構中，包裹著DNA。與蛋白質相比，病毒載體對用于生產它們的細胞的毒性也更大。

Charles River 的技術總監Tony Hitchcock 也認為，病毒載體的產品濃度比蛋白質產品低幾個數量級，而且變化很大。此外，AAV載體不能像蛋白質那樣分泌，而 LV 載體產品穩定性低。AAV 載體還需要分離完整的和空的衣殼，這比蛋白質和mAb 所需的分離更復雜。

“即便如此，圍繞抗體建立的知識和專業技能仍可以作為開發連續病毒載體工藝的重要起點，”Freund這樣評論。然而，鑒于必須克服許多障礙，這個時間框架不會很短。

盡管產生病毒載體的轉染不同于蛋白質表達，但用于轉染步驟的細胞必須生長到適當的細胞密度。“類似于生產重組蛋白或單克隆抗體中的 N-1 生物反應器，細胞量實際上是細胞生長步驟的產物，因此灌流方案可能是合適的，使用與針對重組蛋白和單克隆抗體細胞培養工藝強化而開發的相同解決方案，”Pall制造科學和技術副總裁 Marc Bisschops 這樣認為。

Bisschops 的觀點是：病毒載體的下游純化步驟與蛋白質和mAb 的純化步驟相似，因此，為后者開發的連續解決方案原則上也可應用于病毒載體工藝。關鍵工藝參數不會有根本性的不同，對諸如生物負荷控制等關鍵方面的期望將保持完全相同，但規模可能并不總是合適的。

一般來說，雖然大多數應用于病毒載體工藝的技術都是從其它藥物模式中繼承來的，但Univercells Technologies 的首席技術官Tania Pereira Chilima 指出，一些技術是專門設計用于實現病毒生產中的集成和連續工藝。

連續工藝實現前需解決的問題

大多數連續工藝的開發工作都集中在使用平臺工藝生產的傳統生物藥上，這些平臺工藝對工藝有深入的理解，對工藝行為有更大的確定性。Cytiva的企業解決方案總監 Joe Makowiecki認為，在仍被認為是新產品模式的病毒載體領域，缺乏這種知識庫。

“病毒對環境和工藝條件的敏感性，以及病毒比傳統蛋白質和單克隆抗體更大的事實，以及有限的行業經驗和專業知識，使得病毒載體工藝更難實施工藝強化解決方案。”

Bisschops 觀察到，特別是目前進行的轉染步驟，對于將病毒載體生產的上游工藝轉變為一個完全集成的連續生產平臺來說將是一個挑戰。

例如，Polyplus-transfection的產品經理 Maxime Dumont 指出，由質粒 DNA 和轉染試劑生成的轉染混合物穩定性有限，確定最佳添加時間范圍至關重要。“需要產生更穩定的轉染混合物的轉染試劑才能在真正連續的操作中進行瞬時轉染。”

Freund 也認為，與可生物降解的轉染劑結合的復合物需要有更好的穩定性，以延長轉染過程可以進行的時間。

瞬時轉染帶來的問題可能會隨著生產細胞系的發展而得到解決，這些細胞系可以在不需要瞬時轉染的情況下產生載體。然而，根據ViroCell Biologics 的工藝開發總監Carlo Scala 的說法，制備高滴度穩定生產細胞系非常困難。

此外，一些病毒，特別是 AAV 和腺病毒，是在細胞內產生的，因此需要在轉染步驟后對細胞進行化學裂解，然后用核酸酶處理以降解細胞DNA。Hitchcock指出，以連續的方式執行這樣的步驟是不可能的。為了分離空衣殼和完整衣殼，許多制造商仍在使用超速離心機，雖然有連續超速離心機可用，但要達到所需的純度可能具有挑戰性。

Bisschops 強調的另一個挑戰是目前病毒載體生產的規模。這些產品的應用通常針對較小的患者群體，因此批次規模比大多數mAb 治療藥物小得多，并且需要仍然符合當前良好生產規范(CGMP) 的較小生產系統。“隨著工藝強化和/或連續生物工藝的發展，實現此類系統的挑戰可能會變得更加重要。連接器和傳感器等一次性組件并不總是以合適的尺寸提供，以支持適當的規模。”

針對瞬時轉染的灌流工藝潛力

Scala 說，如果能夠開發出解決方案，上游病毒載體生產可以極大地受益于連續生產。Chilima認為，對于分泌的、細胞外不穩定的產品（例如LV 載體），連續工藝可以實現連續的病毒收獲、澄清、濃縮和冷卻。

雖然接種和病毒生產并不總是能夠轉化為連續工藝，但有一些技術正在被研究作為工藝強化的推動力。例如，固定床生物反應器的使用允許貼壁細胞在非常緊湊、完全受控的生物反應器而不是扁平器皿中生長。“轉染過程和細胞裂解都可以在生物反應器中進行，從而最大限度地減少操作員干預并在整個病毒載體表達過程中保持良好控制（和功能性封閉）狀態，”Bisschops觀察到。

據 Dumont 介紹，其它病毒載體制造商正在通過從批次模式轉換為補料分批模式來實現連續工藝。他指出：“使用灌流工藝作為增加生物量的一種方式是強化轉染過程的一種很有前途的手段”。關鍵是置換耗竭的培養基，從而提供更優化的轉染條件。雖然灌流的使用將取決于生產途徑，但Hitchcock認為，使用基于灌流的工藝可以在病毒感染或質粒轉染之前，增加細胞密度，以提高生產力，或在誘導穩定細胞系生產之前，這兩者都是為了提高產量。

這種方法必須解決的一個挑戰是 HEK 細胞傾向于在更高的細胞密度下聚集。細胞聚集會顯著限制瞬時轉染步驟的效率。“有必要改進和優化培養基以及生物反應器參數，以減少或防止更高細胞密度下的聚集，”Makowiecki這樣認為。

強化下游操作的機會

鑒于許多載體（尤其是 LV 載體等囊膜載體）對剪切力、高鹽濃度和溫度降解的敏感性，下游工藝的時間安排對于避免產品損失至關重要。因此，Scala強調上游載體的連續生產和收獲必須與快速、高效的下游工藝相結合。

Makowiecki 指出，事實上，與重組蛋白和mAb 一樣，載體純化步驟可能非常適合工藝強化，從而提高產量和收率。

Chilima 指出，即使對于細胞內血清型而言，由于必須裂解細胞以收集產品（在工藝結束時以批次工藝模式進行），因此上游連續工藝可能受益較少，但下游操作中的連續工藝將是有益的。“使用模擬移動床層析 (SMB) 等連續工藝技術可能會帶來更高的產能利用率、更快的工藝時間和更低的試劑使用量，以及其它好處。”

Makowiecki 觀察到，層析也可以通過使用大孔分離介質（如基于膜和纖維的設備中的分離介質）來強化，這些介質可以更有效地處理更大的病毒分子，從而實現快速循環。“應用這類解決方案的關鍵是確保整體系統（泵、流路和設備）不會因更高的流速而造成中斷。”

然而，Bisschops 警告，眾所周知，涉及梯度洗脫的層析步驟更難轉化為連續工藝。即便如此，他強調在下游病毒載體生產中仍有許多工藝強化的機會。一個具體的例子是精純步驟，其中膜吸附技術可用于有效分離完整的和空的衣殼。同樣，較大孔徑的膜吸附對較大的產品（如病毒載體）有效工作，因為它們減輕了在傳統填料/基球層析介質中觀察到的緩慢擴散行為。

Hitchcock表示，其它技術，如使用單程切向流過濾(TFF) 以減少層析操作之前的工藝體積以及置換緩沖液，可能很適合下游病毒載體純化工藝。他認為：“對于回收和純化步驟，減少工藝時間和減少產品損失是關鍵驅動力，而這些技術提供了實現這一目標的潛力。”

不過，Bisschops 警告，下游病毒載體工藝中的許多過濾步驟無論如何都是在流穿模式下操作的，并且調整這些過濾器的大小以適應整個批次，而不是將這些步驟配置為循環連續模式，可能會產生很多的意義。

需要穩定生產細胞系

瞬時轉染步驟本身并不容易轉換為連續工藝。需要不穩定的轉染試劑-質粒復合物以及病毒產物對用于載體生產的 HEK 細胞有毒的事實，只是使連續操作變得困難的兩個特征。

因此，為了使連續工藝成為可能，需要能夠在很長一段時間內以高滴度生產病毒載體的穩定生產細胞系。Hitchcock指出，穩定細胞系提供了提高產量水平的潛力，但也提供了更一致的生產力水平。

“擁有一個足夠大的生物反應器和穩定生產細胞系，為后續的下游純化提供足夠的材料，將允許運行有效的連續工藝，”Scala這樣認為。ViroCell Biologics 首席科學官 Farzin Farzaneh 補充道，反過來，通過穩定的載體生產細胞連續生產載體可以顯著提高產量并降低成本和生產時間。

Farzaneh 表示，包括ViroCell 的創新和工藝開發團隊在內的許多團隊正在致力于產生穩定的、高滴度的載體生產懸浮細胞。事實上，已經為LV 載體開發了一些穩定細胞系，許多研究人員也在研究AAV 細胞系。

Makowiecki認為，“獲得穩定的病毒載體生產細胞系是行業內的自然進展；哺乳動物細胞培養已經采用了這一途徑，從而產生了該行業最常用的哺乳動物細胞系，中國倉鼠卵巢細胞。病毒載體正朝著同一個方向發展”。Scala 認為，最好的策略是繼續投資于開發穩定生產細胞系，同時設計/開發可以生產的高滴度、更高物理穩定性的載體。

先進的純化和過濾技術

對病毒載體和其它新模式的需求快速增長，導致人們對為這些具有挑戰性的分子開發適合用途的下游純化解決方案越來越感興趣。

“在過濾器方面，可以為這些大型載體產品尋找減少產品損失的形式，特別是對于可能會遇到重大產品損失的囊膜LV 的工藝，”Hitchcock評論道。他重申，Pall的單程TFF 技術已被證明適用于 AAV 載體，而 Repligen 的切向流深層過濾系統為LV 產品提供了高回收率。

根據 Makowiecki 的說法，人們重新關注基于纖維的技術。“中空纖維技術正在重生，其應用擴展到傳統疫苗領域之外，可用于采用 TFF 工藝的新產品模式，這一工藝是重點。”

更新的納米纖維技術也被引入市場，這些技術被設計用于病毒載體和其它大分子，如質粒DNA 和信使 RNA。“這些纖維技術可以很容易地用于強化層析工藝，”Makowiecki觀察到。

基于纖維的新型層析形式，例如來自Cytiva 和 Astrea 的層析技術，非常適合大型生物復合物，并在流速和改進的結合-洗脫動力學方面顯著減少工藝時間，這是高通量工藝平臺所需的，Hitchcock觀察到。

Makowiecki 預計此類技術將首先用于新模式的批次工藝，然后將在這些操作中獲得的知識與圍繞傳統生物藥連續工藝開發的知識相結合，以開發新模式領域的連續解決方案。

除了新的纖維技術本身，還有大量工作正在開發新的配基，以連接到纖維上，以及用于更傳統的、基于層析填料的基球和膜。Makowiecki 認為，“我們已經開始看到許多不同類型的配基與基質結合使用，不僅基于大孔介質，還基于更傳統的層析介質。這些親和配基對特定載體和載體血清型具有特異性。不過，最終會出現更廣泛的、特定于載體并為許多不同血清型提供良好性能的配基，就像用于mAb 的Protein A 一樣。”

恰當的分析解決方案也必不可少

如果不獲得實時的過程中分析數據，就不可能進行連續工藝。在Bisschops 看來，連續生產病毒載體的最大障礙很可能是分析方面。“適當的過程控制和快速的周轉時間是進一步推動工藝強化的必要條件。”

Hitchcock表示同意，最大的挑戰之一將是過程分析，既涉及在操作期間確定產品濃度的能力，也涉及實施所需的控制、以確保工藝的一致性和穩定性。

Hitchcock強調的一個特殊問題與當前過程分析技術檢測病毒載體生產中遇到的極低蛋白質濃度的能力有關。他觀察到，“通常需要改進在線監測和控制系統，這種能力對于病毒載體的連續工藝至關重要。”

從積極的方面來說，Bisschops 注意到正在取得的進展將有助于增強對生產過程的理解和質量標準，同時減少生產中的可變性，并因此提高產品質量的一致性。“這些發展是進一步提高工藝效率和推動病毒載體生產工藝強化的關鍵。”

潛在的監管優勢

根據 Hitchcock 的說法，從監管的角度來看，改進的過程分析技術對于連續病毒載體生產也至關重要。“過程分析產生的數據對于顯示操作過程中的產品一致性至關重要，無論是在純度方面，還是在效力和與通過批次工藝生產的材料的可比性方面。”

幸運的是，監管機構鼓勵連續工藝，因此為病毒載體制造商提供了機會，使生產平臺的開發和表征與監管預期保持一致，Bisschops表示。

Bisschops說認為，“如果我們對工藝強化采取更全面的觀點，節省時間似乎是一個很好的科學領域，在這個領域中，從常規生物藥產品開發中學習的知識可以大有幫助。例如，使用質量源于設計(QbD) 的原則可以在病毒載體的臨床開發早期解決監管挑戰。通過這種方法，可能可以縮短上市時間，同時降低風險和監管挑戰。”

在這方面，Pall 發布了一個將 QbD 用于AAV 載體的框架，以支持科學家在工藝開發的早期階段解決監管方面的問題。

一切為了提高效率

雖然連續工藝可以提供可衡量的好處，但在完全連續模式下部署病毒載體生產之前顯然存在重大障礙。甚至連續工藝可能不是一個合適的解決方案。

Makowiecki強調，“轉向連續操作的驅動力是提高效率、生產力和整體質量。很多時候，這可以通過優化、新產品推出和強化相結合的方式來實現。實現提高效率、生產力和質量的目標應該是重點，而不僅是為了實施連續的解決方案。”

Hitchcock表示同意，行業很可能會以逐步的方式引入連續工藝，隨著賦能技術的出現，特定的單元操作會變得更加強化。他指出：“將根據與成本收益和產品質量方面可證明的運營效益相關的技術成就來進行工藝強化。”

Dumont 認為，在連續上游工藝成為現實之前，必須開發穩定生產細胞系，其產量與瞬時轉染工藝一樣多。不過，他同意完全連續的操作可能永遠不會對病毒載體起作用，并且可能需要其它提高生產力的方法。

Bisschops認為，從事實上來說連續的病毒載體生產可能不是行業直接關注的一個領域，因為驅動力可能不足以解決所涉及的障礙。相反，他認為，一種更傾向于從整體角度看待工藝強化的方法，包括縮短開發、技術轉移和監管審批的時間，可能會增加更多價值。

“我們不應該將連續生產本身作為一個目標。連續生產是工藝強化的一個子集。這有很多角度，但不限于降低生產成本。它還包括以更智能的工作方式來縮短開發時間，”Bisschops這樣認為。他還認為，現有技術，例如用于貼壁細胞培養的固定床生物反應器和用于層析純化的膜吸附，已經可以用于支持病毒載體生產的工藝強化。