多肽一般是指少于 100 個氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物，其相對分子質量低于10 000。多肽類藥物在治療腫瘤、糖尿病、心血管疾病、肢端體肥大癥、骨質疏松癥、胃腸道疾病、中樞神經系統疾病、免疫疾病以及抗病毒、抗菌等方面具有顯著的療效。多肽如何純化一起來學習下吧。

凝膠過濾的應用

1、生物大分子的純化圖片

凝膠過濾是依據分子量的不同來進行分離的，由于它的這一分離特性，以及它具有簡單、方便、不改變樣品生物學活性等優點，使得凝膠過濾成為純化生物大分子的一種重要手段，尤其是對于一些大小不同，但理化性質相似的分子，用其他方法較難分開，而凝膠過濾無疑是一種合適的方法，例如對于不同聚合程度的多聚體的分離等。

2、分子量測定

凝膠過濾測定分子量操作比較簡單，所需樣品量也較少，是一種初步測定蛋白分子量的有效方法。這種方法的缺點是測量結果的準確性受很多因素影響。由于這種方法假定標準物和樣品與凝膠都沒有吸附作用，所以如果標準物或樣品與凝膠有一定的吸附作用，那么測量的誤差就會比較大。計算公式成立的條件是蛋白基本是球形的，對于一些纖維蛋白等細長形狀的蛋白不成立。另外由于糖的水合作用較強，所以用凝膠過濾測定糖蛋白時，測定的分子量偏大，而測定鐵蛋白時則發現測定值偏小。

3、脫鹽及去除小分子雜質

利用凝膠過濾進行脫鹽及去除小分子雜質是一種簡便、有效、快速的方法，它比一般用透析的方法脫鹽要快得多，而且一般不會造成樣品較大的稀釋，生物分子不易變性。一般常用的是Tandex G-25，并且目前已有多種脫鹽柱成品出售，使用方便，可多次使用。

4、去熱源物質

熱源物質是指微生物產生的某些多糖蛋白復合物使人體發熱的物質，它們是一類分子量很大的物質，所以可以利用凝膠過濾的排阻效應將這些大分子熱源物質與其他相對分子量較小的物質分開。例如對于去除水、氨基酸、一些注射液中的熱源物質，凝膠過濾是一種簡單而有效的方法。

5、溶液的濃縮

利用凝膠顆粒的吸水性可以對大分子樣品溶液進行濃縮。例如將干燥的Tandex（粗顆粒）加入溶液中，Tandex可以吸收大量的水，溶液中的小分子物質也會滲透進入凝膠孔穴內部，而大分子則被排阻在外。通過離心或過濾去除凝膠顆粒，即可得到濃縮的樣品溶液。這種濃縮方法基本不改變溶液的離子強度和pH值。

6、蛋白質的復性

為了減少高濃度下的聚集反應，凝膠過濾層析技術也可以用來進行蛋白的體外復性。層析介質的隔離作用，降低了蛋白之間相互作用產生的聚集，使復性濃度、復性率都得到很大的提高。同時，蛋白經過凝膠過濾層析本身也可得到一定的純化。

兩個重要的因素影響凝膠過濾層析復性蛋白的收率：第一個是變性條件下蛋白質的上樣，第二個是復性緩沖液中蛋白質結構的變化。另外，蛋白質上樣量也會影響蛋白質復性收率，因為在層析柱的頂端會因為上樣量的增加而發生結構的聚集。

為了提高蛋白質復性效率，發展了一種梯度凝膠過濾層析復性方法。在色譜柱中預先設置變性劑濃度的梯度，當復性的蛋白質進入到柱子中后，由于蛋白質的表觀分子量遠遠大于變性劑，從而蛋白質經過了一個變性劑濃度逐步降低的環境，蛋白質逐步地折疊復性，從而有效地降低了聚集體的形成，并能把聚集體和折疊的蛋白質進行分離。

線性梯度在凝膠過濾層析中可能經常會遇到，但是有時有些蛋白質可能在某些變性劑濃度下不穩定，在梯度過程中需要盡快跨越這些濃度過程；有時蛋白質折疊的限速在某些變性劑濃度下，此時需要增加此段的時間，所以在凝膠過濾層析中可以設計不同類型的梯度形式，以滿足不同的蛋白質的復性需要。

分離純化四大原理

1、反相高效液相色譜

反相高效液相色譜（RP-HPLC）是利用非極性的反相介質為固定相，極性有機溶劑或其水溶液作為流動相，根據溶質疏水性的差別進行分離純化的洗脫色譜法。RP-HPLC主要用于分子量低于5000的多肽的分離純化，因其具有分離效果好、分辨率高、重復性好、分析速度快等優點，在多肽的分離純化和制備中得到廣泛應用。目前 RP-HPLC分離柱是以硅膠基質的鍵合相填料為主體。尤其是鍵合 C18 ( Octadecylsilica,ODS )、C8 烷基以及苯基填料的出現，使該技術得到長足發展。這類填料的最大特點是顆粒剛性好，有利于傳質，可以得到很高的柱效，并有良好的選擇性。

2、離子交換色譜

離子交換色譜（IEXC）是以離子交換劑作為固定相，交換劑由固定離子基團及可交換的平衡離子組成。當流動相帶著組分離子通過離子交換柱時，組分離子與可交換的離子進行可逆變換，最后達到交換平衡。離子交換色譜法的原理就是根據不同組分離子對固定離子基團的親和力的差別而達到分離的目的。離子交換色譜又可分為陽離子交換色譜和陰離子交換色譜。相對的可選用的有陽離子交換填料和陰離子交換填料。IEXC最為明顯的優勢在于它的分離條件最接近生物的生理環境，對生物分子有一定的兼容性，以便于保存多肽的生物活性。對多肽分子進行分離純化可采用兩種方式，一是將目的產物離子化，被交換到介質上，雜質不被吸附，從柱流出，稱為“正吸附”。此法優點是目的產物純度高，且可達到濃縮目的，宜處理目的產物濃度低且工作液量大的溶液。另一方式是將雜質離子化后被交換，而目的產物不被交換直接流出，這種方式稱為“負吸附”。采用此法通常可除去50%～ 70 %的雜質，適用于目的產物濃度高的工作液。以上兩種方式的選擇要依據樣品及具體要求而定。無論是正吸附還是負吸附，離子交換色譜均已成為多肽化學中一重要的分離方法。

3、凝膠色譜

凝膠色譜（Gel FiltrationChromatography, GFC)是利用凝膠的網狀結構，根據多肽分子的大小、形狀差異進行分離的一種方法。如人重組生長激素 (hGH)的分離，不同結構、構型的GH在 GFC 柱上的分離行為完全不同，從而可分離不同構型或在氨基酸序列上有微小差異的變異體。一些分子量較大的肽或蛋白均可利用此法分離分析。凝膠色譜具有很多優點：介質為不帶電荷的惰性物質，不與溶質分子作用，因此分離條件溫和，產品收率高，生物活性好；工作范圍廣，分離分子量的覆蓋面大，可分離從幾百至數萬分子量的分子。

4、親和色譜

親和色譜（AC）也稱為親和層析，是一種利用固定相與物質的特異性結合來實現分離和純化目的的方法。

HPLC與其他分離純化方法聯用

肽的種類很多且大多具有相似性，使用單一的分離純化手段已經不能達到理想的分離純化效果。HPLC有可以進行大規模制備等優點，但存在費時、價高等缺點。HPLC與其他分離純化方法技術的聯用，集中了各種方法的優勢，彌補了各技術的不足，在多肽分離純化中已顯示出巨大的優越性。

抓住了以上4點，也就掌握了多肽分離的核心！可以橫掃一切多肽分離的問題啦！