高壓蒸汽滅菌的原理

高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學實驗中最常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經15～30min，可全部殺死鍋內物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌。

請注意高壓蒸汽滅菌的原理：是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。

壓力:100KPa，水蒸氣的溫度:115℃，時間:20min，各種微生物和它們的孢子

壓力:147KPa，水蒸氣的溫度:121℃，時間:15-30min，各種微生物和它們的孢子或芽孢

壓力:156KPa，水蒸氣的溫度:180℃，時間:4h，熱原質（Pyrogen）:熱原質即菌體中的脂多糖

壓力:156KPa，水蒸氣的溫度:250℃，時間:45min，熱原質（Pyrogen）:熱原質即菌體中的脂多糖

壓力:156KPa，水蒸氣的溫度:650℃，時間:1min，熱原質（Pyrogen）:熱原質即菌體中的脂多糖

溫度越高，需時越短，熱穿透能力越強。一般認定115℃-121.3℃，對培養基的成分不產生破壞。

高壓蒸汽滅菌使用細節

高壓蒸汽滅菌是將待滅菌的物品放在一個密閉的加壓滅菌鍋內，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產生蒸汽。待水蒸汽急劇地將鍋內的冷空氣從排氣閥中驅盡，然后關閉排氣閥，繼續加熱，此時由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內的壓力，從而使沸點增高，得到高于100℃的溫度。導致菌體蛋白質凝固變性而達到滅菌的目的。在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。所以飽和蒸汽的滅菌更徹底！

一、高壓滅菌鍋使用前要水加到水位線；

二、將需滅菌的培養基、蒸餾水或其它器皿放入滅菌鍋內，關閉鍋蓋，檢查排氣閥、安全閥狀態（上下排氣閥打開安全閥關合然后加熱，方便空氣排出，上、下排氣閥都同時處于開啟狀態待有水蒸汽從上、下閥溢出，此狀態保持7、8分鐘后，即排出空氣后上排氣閥關合，下排氣閥調小，安全閥保持關合狀態）；

三、打開電源，檢查參數設置是否正確，然后按下“work”鍵，滅菌鍋開始工作；自動派冷氣，到105℃時，底部排氣閥門自動關閉，然后壓力開始上升；

四、壓力升至0.15MPa（121℃）時，滅菌鍋再次自動放氣，然后開始記時，一般培養基滅菌20min，蒸餾水滅菌30min；

五、達到規定的滅菌時間后，關閉電源，打開放氣閥緩慢放氣；當壓力指針降至0.00MPa時，放氣閥無蒸汽排除時，方可開啟鍋蓋。

六、注意事項

1、汽未放盡前，不得開啟高壓鍋；

2、如果滅菌后的培養基在鍋內不及時拿出，需在蒸汽放盡后將鍋蓋打開，切忌將培養基封閉在鍋內過夜。

3、壓力表指針在0.05MPa以上時，不能過快放汽，以防止壓力急速下降，液體滾沸，從培養容器中溢出。

4、操作過程，請注意安全，小心燙傷。

在一個標準大氣壓下水的沸點是100攝氏度，壓力越高,與之對應壓力下的沸點越高，這里是高壓蒸汽鍋,說明壓力肯定大于一個標準大氣壓(通常情況下的地表面的大氣壓強就認為是一個標準大氣壓)，也就是說高壓蒸汽鍋肯定要超過100攝氏度才能沸騰，才能產生蒸汽。至少要等到水煮沸，排出一分鐘左右的蒸汽后再把安全閥關閉，這樣可以使高壓蒸汽鍋里的壓力迅速上升，原來沸騰的水因為壓力的快速上升而停止沸騰，壓力大，沸點高，水蒸汽就變成液體水，而放出大量的汽化潛熱，就是高溫高壓的目的，從而達到殺菌的目的。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大，其原因有三：

一是濕熱中細菌菌體吸收水分，蛋白質較易凝固，因蛋白質含水量增加，所需凝固溫度降低；

二是濕熱的穿透力比干熱大；

三是濕熱的蒸汽有潛熱存在，每1克水在100℃時，由氣態變為液態時可放出2．26kJ（千焦）的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。

在使用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌時，滅菌鍋內冷空氣的排除是否完全極為重要，因為空氣的膨脹壓大于水蒸汽的膨脹壓，所以，當水蒸汽中含有空氣時，在同一壓力下，含空氣蒸汽的溫度低于飽和蒸汽的溫度。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養基由于內外壓力不平衡而沖出燒瓶口或試管口，造成棉塞沾染培養基而發生污染。要100度以上，也就是對應壓力下的沸點后才能使水劇烈沸騰，將鍋內空氣更多的排除。

高溫滅菌操作中常見錯誤的分析

高溫滅菌是指用熱能殺死微生物。其原理是高溫使原生質中的蛋白質變性、使酶失活，致使微生物死亡。高溫滅菌主要有高壓蒸汽滅菌法、干熱滅菌法和灼燒滅菌法幾種。如果操作不當，即達不到預期的滅菌效果。現就常見錯誤分析如下：

1、高壓蒸汽滅菌

蒸汽滅菌屬濕熱滅菌，由于濕熱滅菌有潛能存在，被滅菌物體的溫度比蒸汽的低，蒸汽在其表面凝結成水，放出潛能，可迅速提高被滅菌物體的溫度。又由于水和水蒸汽比空氣的熱容量大、導熱快、穿透力強，所以，與干熱滅菌相比，滅菌需要的溫度低、時間短。由于高壓蒸汽滅菌法水蒸汽的溫度隨其所受壓力的增加而升高，因而滅菌用的高溫蒸汽都是通過加壓獲得的。

手提式高壓滅菌鍋操作中常見的錯誤有：

（1）排氣不徹底。在升壓前應將鍋內冷空氣排凈，因空氣是熱不良導體，若不排凈，冷空氣就會聚集井滯留在滅菌鍋中消毒筒的中下部，圍繞在待滅菌物的周圍。在這種情況下，假若鍋內僅排除一半空氣，當壓力表指針達到105Pa時，鍋內實際溫度僅能達到112℃，比要求的121℃低9℃之多，將導致滅菌不徹底，可能造成大面積染菌。（自動的高壓滅菌鍋上下排氣閥都要打開然后加熱排空氣）

（2）排氣軟管沒有按要求插入滅菌筒的下部，或排氣軟管斷裂、缺失。滅菌鍋內的冷空氣是通過排氣軟管排出的，上述情況將造成滅菌筒外的蒸汽直接經排氣閥排出鍋外，滅菌鍋內的空氣排放受阻。

（3）消毒筒內物品堆積太緊、太滿，阻礙蒸汽的流通和熱交換，使容器內升溫減慢，造成物體內部殺菌不完全。

（4）升溫過快。滅菌的時間是以達到要求溫度后的持續時間計算的，但溫度的升降過程同樣起到殺菌的作用，升降溫度過快會通過影響總的積溫而影響滅菌效果。另外，升溫過快，特別是使用外源蒸汽的情況下，會造成被滅菌物體內部升溫滯后于壓力表指示溫度。

（5）滅菌的物體體積（容量）過大。組織培養中或常規微生物實驗中，高溫蒸汽滅菌通常要在121℃（即蒸汽壓力為1kg／c㎡或5磅／寸2，或0.105MPa）下保溫15min。這一規定僅適用于試管、三角瓶中小于200ml容量的。若體積太大，特別是固體培養基，會造成滅菌不徹底，應適當延長滅菌時間。

（6）任意延長滅菌時間。規定的滅菌溫度和時間是經過科學試驗確定的，只要按照正確的滅菌程序是能達到滅菌目的的。但在實踐中常有人為了“保證徹底滅菌”而任意延長滅菌時間。這樣忽視了殺菌過程中溫度對培養基成分的破壞作用，是得不償失的。

（7）溫度不穩定。滅菌過程中溫度（壓力）忽高忽低，特別是手提式電能滅菌鍋，它沒有控溫裝置，難于控溫。操作者可配置調壓變壓器，通過調節電壓控溫。此外，還常遇到滅菌鍋內加水太少（應加2～3L）；容器內裝的溶液量過多（應少于2／3）；安全閥失靈等問題。

2、干熱滅菌

干熱滅菌指在烘箱160℃溫度下，維持2h，消除物體上的微生物的方法。常見錯誤有：

（1）將滅菌物品（如培養皿）堆摞放置，且堆得過滿、過擠，阻礙空氣流通和熱量的傳遞、交換；

（2）升溫時不打開箱頂通風孔，影響箱內冷空氣及水汽的排除；

（3）高溫（80℃以上）下開箱取物，熱蒸汽噴出造成燒傷及突然降溫，使玻璃器皿破裂；

（4）溫度過高（180℃以上）造成包裝紙、棉塞焦化，失去防菌或過濾作用；

（5）將不耐熱的槍頭、離心管、試管帽、濾器等塑料制品放入烤箱內滅菌，而致熔化。

3、灼燒滅菌

即直接利用火焰將微生物灼燒致死。特點：簡便、迅速、徹底。主要用于接種工具及器皿的滅菌。如接種杯、鑷子、剪刀、玻棒、瓶口及其封口用的鋁箔的滅菌常見的錯誤有：

（1）接種工具的滅菌范圍不夠，如長度不夠，灼燒時沒有旋轉造成內外側滅菌不勻；

（2）接種工具沒有降至常溫即用于接種；

（3）對玻璃器皿灼燒過度，使棉塞、封口膜焦化或熔化。