摘要：肺炎球菌多糖疫苗或多糖蛋白結合疫苗在預防肺炎球菌性疾病中發揮著重要的作用。肺炎鏈球菌是肺炎球菌疫苗研制、生產的重要原材料，也是國家重要的戰略儲備資源，其質量直接或間接影響終產品肺炎球菌疫苗的質量、安全和效力。因此，嚴格控制肺炎球菌疫苗生產用肺炎鏈球菌的質量至關重要。本文對肺炎球菌疫苗生產用肺炎鏈球菌種子批的傳統檢定方法和分子生物學檢定方法(16S rRNA序列測定、基于PCR的血清分型、多位點序列分型、脈沖場凝膠電泳分型和全基因組序列測序)進行概述，并對這些方法的優缺點進行討論，以期為完善生產用肺炎鏈球菌種的質控方法和質量標準提供幫助。

 

關鍵詞：肺炎球菌疫苗；肺炎鏈球菌；傳統檢定方法；分子生物學檢定方法

 

Abstract: Pneumococcal polysaccharide vaccine or polysaccharide conjugate vaccine plays an important role in preventing pneumococcal diseases. Streptococcus pneumoniae is an important raw material for the development and production of pneumococcal vaccine, as well as an important national strategic reserve resource. Its quality directly or indirectly affects the quality, safety and efficacy of the final product pneumococcal vaccine. Therefore, it is very important to strictly control the quality of Streptococcus pneumoniae used for the production of pneumococcal vaccine. In this paper, the traditional quality control method and molecular biological method (16S rRNA gene sequencing, PCRbased serotyping, multilocus sequence typing, pulsed field gel electrophoresis and whole genome sequencing) used for the quality control of the seed batch of Streptococcus pneumoniae for pneumococcal vaccine production are summarized, and the advantages and disadvantages of these methods are discussed, in order to provide supports for the improvement of quality control methods and quality standards of Streptococcus pneumoniae for pneumococcal vaccine production.

 

Key words：pneumococcal vaccine; Streptococcus pneumoniae; traditional quality control method; molecular biological methods

 

1  引言

 

肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)是引起兒童和老年人肺炎球菌性疾病的主要病原菌，其感染可引起急性中耳炎、鼻竇炎、肺炎、腦膜炎、菌血癥等[1]。WHO已將肺炎球菌性疾病列為需“極高度優先”使用疫苗預防的疾病。肺炎球菌多糖疫苗或多糖蛋白結合疫苗在預防肺炎球菌性疾病中發揮著重要的作用。國家藥品監督管理局網站查詢顯示，我國有5款23價肺炎球菌多糖疫苗(PPSV23)和3款13價肺炎球菌多糖結合疫苗(PCV13)上市銷售。根據肺炎鏈球菌主要毒力因子莢膜多糖抗原的不同，肺炎鏈球菌可以分為90多個血清型[2]。其中，最流行的血清型是19F、19A、23F、14、6A和6B型[3]。目前肺炎球菌疫苗生產用菌種包括24個型別，分別是1、2、3、4、5、6A、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F型。肺炎鏈球菌是肺炎球菌疫苗研制、生產的重要原材料，也是國家重要的戰略儲備資源，其質量直接或間接影響肺炎球菌疫苗的質量、安全和效力[4]。因此，嚴格控制肺炎鏈球菌生產菌種的質量至關重要。

 

肺炎鏈球菌生產菌種質量控制應符合《中華人民共和國藥典》(簡稱《中國藥典》)2020年版三部“生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制”的有關規定。生產菌種應建立原始種子批、主種子批和工作種子批三級種子批系統。原始種子應驗明其歷史、來源和生物學特性。工作種子批的生物學特性應與原始種子一致。每批主種子批和工作種子批均應按照國家藥品監督管理部門批準的標準和生產規程的要求保管、檢定和使用。生產用菌種主種子批檢定一般應包括培養特性、革蘭氏等染色方法鏡檢、生化反應、血清學試驗、毒力試驗、免疫效價測定、培養物純度、活菌數測定、16S rRNA 序列測定、全基因序列測定等項目[5]。

 

培養特性、染色鏡檢、生化反應、膽汁溶菌試驗、奧普托欣試驗和莢膜腫脹試驗等傳統的經典肺炎鏈球菌質量控制方法在菌株的分離、鑒定和質量控制中發揮了重要的作用[6]，但傳統方法需要活菌操作，對實驗人員經驗和實驗室生物安全級別有較高要求，且存在無法準確分辨菌株之間的差異的局限。近年來，以16S rRNA序列測定、基于PCR的血清分型(PCR­based serotyping)、多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)、脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型和全基因組序列測序(whole genome sequencing)為代表的分子生物學方法，以其快速、敏感性高、特異性強以及分辨率高等優點，且能夠識別株水平的菌種差異，在細菌鑒定、流行病學調查、系統進化研究等方面發揮了重要的作用，也逐漸應用于肺炎鏈球菌的分子鑒定中[7­，8]。

 

本文對肺炎球菌疫苗生產用肺炎鏈球菌種子批的傳統檢定方法和分子生物學檢定方法進行概述，并對這些方法的優缺點進行討論，以期為完善生產用肺炎鏈球菌種的質控方法和質量標準提供幫助。

 

2  肺炎鏈球菌種子批的傳統檢定方法

 

《中國藥典》2020年版三部通則中對生物制品生產用菌種的原始種子批、主種子批和工作種子批均有相應的檢定要求[5]。表1列出了《中國藥典》收錄的23價肺炎球菌多糖疫苗種子批的檢定項目和相應的檢定標準，這些規定對統一和規范疫苗生產企業對肺炎疫苗生產菌種的質量控制，從源頭上把控肺炎疫苗的質量起到關鍵作用。

 

在實際檢驗過程中，肺炎鏈球菌種子批的培養特性、染色鏡檢、生化反應、膽汁溶菌試驗、奧普托欣試驗和莢膜腫脹試驗，很少出現問題，但這些試驗主要依靠檢測人員的直接觀察，主觀性強，對檢測人員的經驗要求較高。采用糖發酵方法的生化反應鑒定時間持續3～5d。針對生化反應情況，采用梅里埃全自動細菌鑒定試驗系統(vitek2)或BIOLOG高通量微生物表型及鑒定分析系統進行生化反應檢定，鑒定工作一般可以縮短在24 h內完成。

 

近年來，國內外均有文獻報道鑒定出對奧普托欣(Optochin)耐藥的肺炎鏈球菌[9­-12]。Burton等[13]直接使用具有Optochin抗性的肺炎鏈球菌作為肺炎球菌抗體多重調理吞噬試驗(multiplexed opsonization assay, MOPA)的靶菌，用于評價肺炎球菌疫苗的效力。在肺炎鏈球菌種子批檢定中，發現個別企業的某些型別的肺炎鏈球菌奧普托欣試驗抑菌圈直徑小于14 mm或者處于臨界狀態，但膽汁溶菌試驗為陽性，表明采用的生產菌種為耐奧普托欣肺炎鏈球菌。目前，Optochin試驗僅作為一種肺炎鏈球菌鑒定的手段，抑菌圈直徑小于14 mm或者處于臨界狀態，也可能是肺炎鏈球菌，需要輔助以膽汁溶菌試驗進一步證實。肺炎球菌疫苗多為組分疫苗，奧普托欣抗性肺炎鏈球菌對肺炎鏈球菌莢膜多糖生產是否具有影響，可否用于肺炎球菌疫苗的生產，還未見相關報道，需要后續進一步驗證。

 

 

3  肺炎鏈球菌種子批的分子生物學檢定方法

 

3.1  16S rRNA序列測定

 

16S rRNA序列測定是通過對細菌16S核糖體RNA(16S ribosomal RNA gene, 16S rRNA )基因特征序列的測定，實現細菌的生物學鑒定。細菌16S rRNA基因全長約1 500 bp，包含9個可變區(variable region，V區)和10個恒定區(Constant region，C區)，在結構與功能上具有高度保守性，是細菌分類和鑒定中得到廣泛應用的DNA特征序列之一。細菌性疫苗生產用菌種16S rRNA序列測定可參照《中國藥典》2020年版四部通則“1021 細菌DNA特征序列鑒定法”進行[14，15]。

 

《中國藥典》方法擴增的是16S rRNA基因V1～V3可變區核酸序列，采用的擴增引物是16SV1F和16SV3R，擴增產物大小約為500 bp。以擴增引物作為測序引物對擴增產物進行序列測定，從而獲得擴增產物的核酸序列，核酸序列需去除引物序列，序列方向應與16SV1F引物方向一致。有一些細菌可能在V1～V3可變區外出現基因多態性，對于特定菌種建議使用16S rRNA基因全長引物27F和1492R進行擴增分析[14，16]。16S rRNA序列測定結果判定是“將獲得的細菌DNA特征序列與經驗證過的專用數據庫進行比對，根據比對結果進行判定。”，但未對比對的數據庫做出具體規定。目前普遍使用的比對數據庫有美國的NCBI數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)和韓國的EzBioCloud 16S數據庫(https：//www.ezbiocloud.net/)。NCBI數據庫收錄的16S rRNA基因數據量大，但缺乏有效的驗證和篩選。EzBioCloud 16S數據庫是經過有效驗證和質量篩選的、以收錄模式菌株數據為主的數據庫。雖然兩個數據庫比對的結果大多數情況下是一致的，但EzBioCloud 16S數據庫可信度更高[17]。

 

16S rRNA序列測定可以準確鑒定絕大多數菌種的種屬，但對同一種屬內親緣關系很近的種分辨率不夠。多價肺炎球菌疫苗生產菌種涉及20多個不同血清型別，16S rRNA序列測定可以將生產菌種鑒定到肺炎鏈球菌，但無法區分各個不同血清型別的疫苗生產菌種[16]，如需進一步區分可以進行基于PCR的血清分型。

 

3.2  基于PCR的血清分型(PCR­based serotyping)

 

除3型和37型采用合成酶途徑(synthase)外，其它所有型別的肺炎鏈球菌莢膜多糖(capsular polysaccharide, CPS)均是由依賴多糖重復單位聚合酶(Wzy)的途徑合成，由位于染色體上的莢膜多糖合成基因簇(cps loci)控制，cps基因簇介于dexB和aliA基因之間[18]。目前已完成90個血清型的cps基因序列測定[19]。cps基因簇的前四個基因(cpsA、cpsB、cpsC和cpsD)在幾乎所有血清型中都是保守的，而位點的中心部分包含血清型特異性基因，這些基因是通過基于PCR的方法區分肺炎鏈球菌的基礎。研究人員以cps基因簇為靶基因，設計了一系列引物，建立了基于PCR的檢測分析肺炎鏈球菌血清型的方法。美國疾病預防與控制中心(CDC)官網公布了鑒定41種肺炎鏈球菌莢膜血清型的引物序列(https：//www.cdc.gov/streplab/pneumococcus/resources.html#deduction­conventional)。表2列出了24種肺炎球菌疫苗血清型特異性基因及PCR產物理論片段的大小。目前，已經有文獻發表基于PCR的血清分型方法適用于肺炎鏈球菌國家標準菌株的鑒定和質量控制[16]。

 

與傳統的血清凝集血清型分析方法比較，基于PCR的血清型分型方法具有不要求活菌培養、快速、靈敏的特點，但仍存在一些血清型不能精確分型問題，如6A和6B型，20A和20B。由于6A和6B的型特異性基因wci P的大小相同，且6A與6B之間僅是一個單堿基的差別(G584A)，PCR血清分型不能準確區分，需要通過wci P基因序列測定進一步區分6A和6B血清型[20-­22]。20型肺炎鏈球菌是肺炎球菌疫苗包含的重要血清型別。研究結果表明，20型肺炎鏈球菌的莢膜多糖具有六糖重復單位和七糖重復單位2種結構。具有六糖重復單位的20型被命名為20A亞型，七糖重復單位的20型被命名為20B亞型，基于wci L的PCR血清分型雖然能夠將20型肺炎鏈球菌與其他型別分開，但無法區分20A和20B，還需要進行wha F基因測序，對20 型肺炎鏈球菌進行進一步區分[23]。

 

 

此外，由于有些型別的肺炎鏈球菌血清型特異性基因PCR產物的大小相近，凝膠電泳區分度有限，如果結合分辨率更高毛細管電泳進行PCR產物的分析，能夠更加精確的進行血清型的鑒定[24]。

 

3.3  多位點序列分型(multilocus sequence typing，MLST)

 

肺炎鏈球菌MLST分型，即PCR擴增肺炎鏈球菌7種看家基因(aroE、gdh、gki、recP、spi、xpt和ddl)，并將測序得到的7個看家基因序列與肺炎鏈球菌MLST數據庫(https：//pubmlst.org/organisms/streptococcus­pneumoniae/)進行比對，獲得相應的等位基因編號(或者申請新的編號)，所有等位基因的編號(aroEgdhgkirecPspixptddl)組成菌株最終的基因序列型(sequence type，ST)。截止到2022年2月2日，MLST數據庫已收集了全世界不同國家和地區、不同來源的73 777株肺炎鏈球菌的MLST信息，共發現283 046種序列型[25]。Zhou M等[26]研究了中國300株侵襲性肺炎鏈球菌的MLST分布，發現最常見的 ST型是分別是ST320、ST81、ST271、ST876和ST3173。Shi W等[27]從兒童中分離的15群肺炎鏈球菌中最常見的克隆群(clonal complex)是CC3397、CC6011、CC10088、CC9785和ST8589。Peng S等[28]用MLST方法研究83株肺炎鏈球菌，發現最常見的ST型是ST271、ST320和ST3397。陳瓊等[29­-30]通過MLST獲得了6群和11群肺炎鏈球菌疫苗生產用菌種不同的ST型。

 

MLST分型方法具有準確、快速、易于標準化、便于在不同實驗室間進行比較分析的特點，可以檢測到菌株特征性的ST，并可反映菌株之間的分子進化關系[31]。不同血清型的肺炎鏈球菌通常具有不同的ST型，同一血清型內的不同菌株可能具有相同的ST型，所以，當同一血清型的不同生產用菌株具有相同的ST型時，需要采用分辨率更高的方法進行準確鑒定，如脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型或全基因組測序的方法。

 

3.4  脈沖場凝膠電泳(pulsed field gel electrophoresis，PFGE)分型

 

肺炎鏈球菌脈沖場凝膠電泳是先將肺炎鏈球菌包埋于瓊脂塊中，原位裂解膠塊中的菌體，再利用限制性核酸內切酶(通常為 Sma I)對菌體全基因組DNA進行酶切，酶切片段進行脈沖場凝膠電泳后，通過專業的聚類分析軟件進行電泳圖譜和親緣關系分析的一種分型方法[32­-33]。PFGE分型方法因其高分別率，被認為是研究近緣菌株間差異和進化的金標準。研究結果表明相同的血清型或ST型菌株可能具有不同的PFGE圖譜[16]。黃洋等[34]用PFGE分型方法獲得了24株檢測肺炎球菌疫苗功能性抗體的標準株的PFGE圖譜，發現各血清群/型的菌株PFGE圖譜具有12～15個特征性的條帶。PFGE方法準確、重復性好以及分辨率高，非常適合于菌株的流行病學溯源分析，在肺炎鏈球菌相同血清型和ST型菌株的鑒定上很有優勢，其主要不足是操作步驟相對繁瑣、實驗影響因素多、實驗周期較長，不易標準化。

 

3.5  全基因組序列測序(whole genome sequencing)

 

近年來，基因組測序技術發展迅速，測序成本逐漸下降，測序周期縮短、測序精度不斷提高，二代、三代基因組測序技術逐漸在病原體監測、疫苗等生物制品研發及生產用菌毒種質量控制中得到應用[35-­38]。截止2022年2月，NCBI數據庫中收錄的已完成全基因組測序的肺炎鏈球菌菌株有9 029株。基因組大小約為2.085 98 Mb，平均GC含量約為39.6%，約編碼1951個基因。測序使用的主要方法包括Illumina平臺、PacBio平臺及最新的單分子Nanopore測序平臺[39­-41]。采用基因組測序的手段不但可以解析肺炎鏈球菌本身蘊含的全部遺傳信息，還能夠全面的了解疫苗應用后肺炎鏈球菌菌群發生的適應性變化，從而為新型疫苗的研發提供指導。Croucher NJ等[42]利用Illumina HiSeq平臺對收集的616株兒童攜帶的肺炎鏈球菌進行全基因組測序，發現疫苗免疫接種后，疫苗血清型引起的肺炎球菌疾病的發病率下降，而非疫苗血清引起的疾病增加，出現血清型替換現象。Li L等[43]采用三代Pacific Biosciences 和 Illumina Miseq 測序平臺對19A型肺炎鏈球菌基因組數據進行了比較基因組學分析。Nakano S等[44]對19A型ST320菌株進行了基于基因組數據的系統區域分布研究。Rockett RJ等[45]對采用基因組測序的方法對PCV疫苗應用后19群肺炎鏈球菌基因組維度的差異進行了分析。Yan Z等[46]用基因組測序的方式對肺炎鏈球菌血清型和ST型等進行分析，發現最常見的血清型是19F、19A、6B、6A和14，主要的ST型為ST271、ST320和ST90。Gagetti P等[47]采用全基因測序方法研究肺炎鏈球菌群體結構、ST分型和克隆群(clonal complexes，CCs)。Cuppone AM等[48]使用Nanopore 和Illumina相結合的測序技術測定了肺炎鏈球菌Rx1的全基因組序列，基因組全長2.03 Mb，有2 054個開放閱讀框(open reading frame，ORF), GC含量39.72%。

 

《中國藥典》2020年版三部通則《生物制品生產檢定用菌毒種管理及質量控制》中要求建立生產用菌種種子批全基因序列的背景資料，生產用菌種主種子批應進行全基因序列測定。目前，可以利用不同的測序平臺在短時間內獲得生產用菌毒種全基因組序列結果，但由于測序樣本制備的完整性不佳或不同的測序技術所用的基因組拼接算法的不同，可能會導致采用不同測序技術得到基因組序列存在差異，對基因組測序結果的解析造成困難。與病毒相比，建立基于細菌全基因組序列的質量標準比較困難，建議在進行不同批次的菌種全基因組比較時，采用同一種測序技術平臺，重點對影響菌種質量或產品質量的關鍵區域，如莢膜多糖合成位點(cps loci)進行比對分析，針對不同的區域制定相應的質量標準。

 

根據各分子生物檢測方法的特點，表3列出了肺炎鏈球菌生產菌種種子批分子生物學檢定項目及暫行的質量標準，希望可以作為肺炎鏈球菌經典的檢定方法有力補充，進一步完善肺炎鏈球菌生產菌種的信息。

 

 

4  總結與展望

 

肺炎球菌多糖疫苗或多糖蛋白結合疫苗在預防肺炎球菌性疾病中發揮著重要的作用。肺炎鏈球菌是肺炎球菌疫苗研制、生產的重要原材料，也是國家重要的戰略儲備資源，其質量直接或間接影響終產品肺炎球菌疫苗的質量、安全和效力。因此，嚴格控制肺炎球菌疫苗生產用肺炎鏈球菌質量至關重要，應該從菌種的來源、種子批系統的建立及檢定、傳代次數、生物安全等方面重點關注和全面嚴格要求。其中，種子批系統的建立及檢定又是重中之重。

 

肺炎鏈球菌傳統的經典的檢定方法在各級種子批的檢定過程中發揮了重要的作用，對肺炎疫苗的質量起到基礎的保障作用[6]，但經典的檢定方法主要以區分菌株的表型差異為主，需要活菌操作，主觀性強，對操作人員的經驗有較高要求，不能很好地區分相同表型的不同菌株之間的差別。近年來，逐漸成熟和經過實踐驗證的分子生物學檢測方法，如16S rRNA序列測定、基于PCR的血清分型、MLST分型、PFGE分型及全基因組測序以其快速、敏感性高、特異性強以及分辨率高等優點，逐漸被應用于肺炎鏈球菌的鑒定和溯源分析中。然而，由于不同分子分型方法的基本原理不同，再加肺炎鏈球菌的型別眾多，可能會導致不同方法對同一菌株的分型結果并不完全一致，且各種方法均存在自身的缺點，例如，16S rRNA序列測定無法區分不同型別的肺炎鏈球菌；基于PCR的血清型分型方法存在一些血清型不能精確分型問題，如6A和6B型，20A和20B；MLST分型無法區分具有相同ST型的同一血清型的不同菌株；PFGE分型操作步驟相對繁瑣、實驗影響因素多、實驗周期較長，不易標準化；建立基于細菌全基因組序列的質量標準比較困難。因此，在肺炎鏈球菌生產菌種檢定中在傳統經典檢定方法的基礎上，應選用一種或幾種分子生物學方法作為生產菌種的補充檢定方法，并推進分子生物學方法的標準化，最終形成一套操作簡便、分辨力強、靈敏度高、重復性好的生產菌種質量檢定方法和標準，確保生產用肺炎鏈球菌菌種的準確無誤，從源頭上為肺炎球菌疫苗產品的質量保駕護航。

 

總之，本文對肺炎球菌疫苗生產用肺炎鏈球菌種子批的傳統檢定方法和分子生物學檢定方法進行概述，通過對生產用菌種實際檢定中出現的相關問題研究探討，厘清了一些質量控制的薄弱環節，為后續進一步根據不同檢驗方法的特點制定新的適宜的質量標準提供幫助。

 

參考文獻

 

[1]  中華預防醫學會， 中華預防醫學會疫苗與免疫分會. 肺炎球菌性疾病免疫預防專家共識(2020版)[J]. 中華流行病學雜志， 2020, 41(12)：1945

 

Chinese Preventive Medical Association, Vaccine and Immunology Branch of Chinese Preventive Medical Association.Expert consensus on immunoprophylaxis of pneumococcal disease(2020 version)[J]. Chin J Epidemiol, 2020, 41(12)：1945

 

[2]  GENO KA, GILBERT GL, SONG JY, et al. Pneumococcal capsules and their types: past, present, and future[J]. Clin Microbiol Rev, 2015, 28(3): 871

 

[3]  WANG Q, SHI W, LI Y, et al. Serotype distribution of Streptococcus pneumoniae isolated from children hospitalized in Beijing children′s hospital (2013­2019)[J]. Vaccine, 2020, 38(49)：7858

 

[4]  王軍志.疫苗的質量控制與評價[M]. 北京：人民衛生出版社， 2013：79

 

WANG JZ.Vaccine quality control and evaluation[M]. Beijing：People′s Medical Publishing House, 2013：79

 

[5]  中華人民共和國藥典2020年版.三部[S]. 2020：8

 

ChP 2020. Vol Ⅲ[S]. 2020：8

 

[6]  陳馳， 肖磊， 石繼春， 等. 277株肺炎鏈球菌生物學鑒定及血清學分型結果分析[J]. 中國醫藥導刊， 2011, 13(10): 1774

 

CHEN C, XIAO L, SHI JC, et al. Identification and serotyping result analysis of 277 strains of Streptococcus pneumoniae[J].Chin J Med Guide, 2011, 13(10)：1774

 

[7]  楊越， 葉強.肺炎鏈球菌分子分型方法研究進展[J]. 中華微生物學和免疫學雜志， 2013, 33(10)：789

 

YANG Y, YE Q.Advances in molecular typing of Streptococcus pneumoniae[J]. Chin J Microbiol Immunol, 2013, 33(10)：789

 

[8]  EL AILA NA, EMLER S, KAIJALAINEN T, et al. The development of a 16S rRNA gene based PCR for the identification of Streptococcus pneumoniae and comparison with four other species specific PCR assays[J]. BMC Infect Dis, 2010, 10：104

 

[9]  SOUZA ARV, DE PINA SECM, COSTA NS, et al. Description of optochinresistant Streptococcus pneumoniae due to an uncommon mutation in the atpA gene and comparison with previously identified atpC mutants from Brazil[J]. Sci Rep,2021, 11(1)：7936

 

[10]  王奔， 王曉， 王旭娜， 等. 兒童痰液標本中耐奧普托欣肺炎鏈球菌的分離及藥敏情況[J]. 中國衛生檢驗雜志，2021, 31(10)：1201

 

WANG B, WANG X, WANG XN, et al. Isolation and drug sensitivity of optopoxinresistant Streptococcus pneumoniae from sputum samples of children[J]. Chin J Health Lab Tec, 2021, 31(10)：1201

 

[11]  NUNES S, SÁLEÃO R, DE LENCASTRE H. Optochin resistance among Streptococcus pneumoniae strains colonizing healthy children in Portugal[J]. J Clin Microbiol, 2008, 46(1)：321

 

[12]  PIKIS A, CAMPOS JM, RODRIGUEZ WJ, et al. Optochin resistance in Streptococcus pneumoniae: mechanism,significance, and clinical implications[J]. J Infect Dis, 2001, 184(5)：582

 

[13]  BURTON RL, NAHM MH. Development and validation of a four fold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies[J]. Clin Vaccine Immunol, 2006, 13(9): 1004

 

[14]  ABELLAN­SCHNEYDER I, MATCHADO MS, REITMEIER S, et al. Primer, pipelines, parameters: issues in 16S rRNA gene sequencing [J]. mSphere, 2021, 6(1)：e01202­20

 

[15]  中華人民共和國藥典2020年版.四部 [S]. 2020: 通則1021

 

ChP 2020. Vol Ⅳ[S]. 2020: General Chapters 1021

 

[16]  李康， 黃洋， 徐瀟， 等.19群肺炎鏈球菌國家標準菌株分子特征分析及在菌株質量控制中的應用[J].微生物學免疫學進展， 2019, 47(6)：20

 

LI K, HUANG Y, XU X, et al. Molecular characterization of national standard strains of serogroup 19Streptococcus pneumoniae and its application in quality control[J]. Prog Microbiol Immunol, 2019, 47(6)：20

 

[17]  YOON SH, HA SM, KWON S, et al. Introducing EzBioCloud: a taxonomically united database of 16S rRNA gene sequences and whole­ genome assemblies[J]. Int J Syst Evol Microbiol, 2017, 67(5)：1613

 

[18]  AANENSEN DM, MAVROIDI A, BENTLEY SD, et al. Predicted functions and linkage specificities of the products of the Streptococcus pneumoniae capsular biosynthetic loci [J]. J Bacteriol, 2007, 189(21): 7856

 

[19]  BENTLEY SD, AANENSEN DM, MAVROIDI A, et al.Genetic analysis of the capsular biosynthetic locus from all 90 pneumococcal serotypes[J]. PLoS Genet. 2006, 2(3)：e31

 

[20]  SONG JH, BAEK JY, KO KS. Comparison of capsular genes of Streptococcus pneumoniae serotype 6A, 6B, 6C, and6D isolates[J]. J Clin Microbiol, 2011, 49(5)：1758

 

[21]  陳瓊， 李康， 梁麗， 等.應用分子生物學方法鑒定6群肺炎鏈球菌血清型[J]. 微生物學免疫學進展， 2016, 44(4)：12

 

CHEN Q, LI K, LIANG L, et al. Identification of Streptococcus pneumonia serogroup 6 by molecular biological technology[J]. Prog Microbiol Immunol, 2016, 44(4)：12

 

[22]  陳瓊， 陳馳， 石繼春， 等.應用PCR 技術和wciP基因測序方法鑒定6群肺炎鏈球菌血清型[J]. 中華微生物學和免疫學雜志， 2014, 34(4)：315

 

CHEN Q, CHEN C, SHI JC, et al. PCR analysis and wciP gene sequencing for determining the serotypes of Streptococcus pneumonia serogroup 6 strains[J].Chin J Microbiol Immunol, 2014, 34(4)：315

 

[23]  陳瓊， 李康， 徐瀟， 等.應用whaF基因序列鑒定20型肺炎鏈球菌血清型[J]. 微生物學免疫學進展， 2016, 44(2)：16

 

CHEN Q, LI K, XU X, et al. Identification of Streptococcus pneumonia serotype 20 with whaF gene sequencing[J]. Prog Microbiol Immunol, 2016, 44(2)：16

 

[24]  SELVA L, DEL AMO E, BROTONS P, et al.Rapid and easy identification of capsular serotypes of Streptococcus pneumoniae by use of fragment analysis by automated fluorescence based capillary electrophoresis[J]. J Clin Microbiol, 2012, 50(11)：3451

 

[25]  JOLLEY KA, BRAY JE, MAIDEN MCJ. Openaccess bacterial population genomics: BIGSdb software, the PubMLST.org website and their applications[J]. Wellcome Open Res, 2018, 3：124

 

[26]  ZHOU M, WANG Z, ZHANG L, et al.Serotype distribution, antimicrobial susceptibility, multilocus sequencing type and virulence of invasive Streptococcus pneumoniae in China: a six­year multicenter study[J]. Front Microbiol,2021, 12：798750

 

[27]  SHI W, DU Q, YUAN L, et al.Antibiotic resistance and molecular biological characteristics of non­13­valent­pneumococcal conjugate vaccine serogroup 15 Streptococcus pneumoniae isolated from children in China[J]. Front Microbiol, 2021, 12：778985

 

[28]  PENG S, REN H, DENG J, et al.Genotypic and phenotypic characteristics of Streptococcus pneumoniae from community acquired pneumonia patients and healthy asymptomatic participants in Sichuan province, China[J]. BMC Infect Dis, 2021, 21(1)：1030

 

[29]  陳瓊， 龍新星， 李紅， 等.6群肺炎鏈球菌莢膜多糖合成相關基因的分子生物學研究[J].微生物學免疫學進展，2017, 45(4)：8

 

CHEN Q, LONG XX, LI H, et al.Biomolecular analysis of capsular polysaccharide synthesis genes from Streptococcus pneumoniae serogroup 6[J]. Prog Microbiol Immunol, 2017, 45(4)：8

 

[30]  陳瓊， 龍新星， 李紅， 等.11群肺炎鏈球菌莢膜多糖合成相關基因的分子生物學研究[J].微生物學免疫學進展，2018, 46(5)：49

 

CHEN Q, LONG XX, LI H, et al.Analysis of capsular polysaccharide synthesis genes from Streptococcus pneumoniae serogroup 11[J]. Prog Microbiol Immunol, 2018, 46(5)：49

 

[31]  錢婧， 薛蓮， 謝貴林， 等. 171株兒童侵襲性肺炎鏈球菌血清分型和多位點序列分型研究[J]. 臨床兒科雜志，2012, 30(2): 187

 

QIAN J, XUE L, XIE GL, et al.Serotyping and multilocus sequence typing of 171 isolates from children with invasive pneumococcal diseases[J]. J Clin Pediatr, 2012, 30(2)：187

 

[32]  MCELLISTREM MC, STOUT JE, HARRISON LH. Simplified protocol for pulsed field gel electrophoresis analysis of Streptococcus pneumoniae[J]. J Clin Microbiol, 2000, 38(1)：351

 

[33]  李馬超， 張麒， 任紅宇， 等.我國部分地區肺炎鏈球菌血清分型與脈沖場凝膠電泳分型分析[J]. 中國疫苗和免疫，2010, 16(3)：265

 

LI MC, ZHANG Q, REN HY, et al.Analysis on pneumococcus isolated from part of China using serotype and pulsed­field gel electrophoresis[J]. Chin J Vacc Immun, 2010, 16(3)：265

 

[34]  黃洋， 徐瀟， 李康， 等.檢測肺炎球菌疫苗功能性抗體的標準株分子特征分析[J]. 中華實驗和臨床病毒學雜志，2021, 35(5)：509

 

HUANG Y, XU X, LI K, et al. Molecular genetic analysis of standard strains for functional antibody detection of pneumococcal polysaccharide vaccine[J]. Chin J Exp Clin Virol, 2021, 35(5)：509

 

[35]  BENTLEY SD, LO SW. Global genomic pathogen surveillance to inform vaccine strategies: a decade­long expedition in pneumococcal genomics[J]. Genome Med, 2021, 13(1)：84

 

[36]  ALMEIDA SCG, LO SW, HAWKINS PA, et al. Genomic surveillance of invasive Streptococcus pneumoniae isolates in the period prePCV10 and postPCV10 introduction in Brazil[J]. Microb Genom,2021, 7(10)：000635

 

[37]  KOZÁKOVÁ J, OKONJI Z, HONSKUS M. Population analysis of Streptococcus pneumoniae serotype 19A by whole genome sequencing in the Czech Republic and in Europe after serotype 19A inclusion in pneumococcal conjugate vaccine[J]. Epidemiol Mikrobiol Imunol, 2021, 70(2)：110

 

[38]  NAGARAJ G, GOVINDAN V, GANAIE F, et al. Streptococcus pneumoniae genomic datasets from an Indian population describing prevaccine evolutionary epidemiology using a whole genome sequencing approach[J]. Microb Genom, 2021, 7(9)：000645

 

[39]  GOLDEN AR, ADAM HJ, BAXTER M, et al. Whole genome characterization of Streptococcus pneumoniae from respiratory and blood cultures collected from Canadian hospitals before and after PCV13 implementation in Canada: Focus on serotypes 22F and 33F from CANWARD 2007­2018[J]. Vaccine, 2021, 39(39)：5474

 

[40]  SLAGER J, APRIANTO R, VEENING JW. Deep genome annotation of the opportunistic human pathogenStreptococcus pneumoniae D39[J]. Nucleic Acids Res, 2018, 46(19)：9971

 

[41]  GARCIA­GARCIA S, PEREZARGUELLO A, HENARES D, et al. Rapid identification, capsular typing and molecular characterization of Streptococcus pneumoniae by using whole genome nanopore sequencing[J]. BMC Microbiol, 2020, 20(1)：347

 

[42]  CROUCHER NJ, FINKELSTEIN JA, PELTON SI, et al. Population genomics of post­vaccine changes in pneumococcal epidemiology[J]. Nat Genet, 2013, 45(6)：656

 

[43]  LI L, ZHOU J, LI M, et al. Comparative genomic analysis of Streptococcus pneumoniae strains: penicillin non­susceptible multi­drug­resistant serotype 19A isolates[J]. Curr Microbiol, 2022, 79(2)：49

 

[44]  NAKANO S, FUJISAWA T, CHANG B, et al. Wholegenome analysisbased phylogeographic investigation of Streptococcus pneumoniae serotype 19A sequence type 320 isolates in Japan[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2022, 66(2)：e0139521

 

[45]  ROCKETT RJ, OFTADEH S, BACHMANN NL, et al. Genomewide analysis of Streptococcus pneumoniae serogroup 19 in the decade after the introduction of pneumococcal conjugate vaccines in Australia[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 16969

 

[46]  YAN Z, CUI Y, HUANG X, et al. Molecular Characterization based on wholegenome sequencing of Streptococcus pneumoniae in children living in southwest China during 20172019[J]. Front Cell Infect Microbiol,2021, 11：726740

 

[47]  GAGETTI P, LO SW, HAWKINS PA, et al. Population genetic structure, serotype distribution and antibiotic resistance of Streptococcus pneumonia causing invasive disease in children in Argentina[J]. Microb Genom, 2021, 7(9)：000636

 

[48]  CUPPONE AM, COLOMBINI L, FOX V, et al. Complete genome sequence of Streptococcus pneumoniae strain Rx1, a Hex mismatch repair deficient standard transformation recipient[J]. Microbiol Resour Announc, 2021, 10(41)：e0079921