前 言  色譜技術日新月異，分離技術五花八門。對于我們這些從事色譜的工作者，工作中經常碰到一些難以分離的情況，遇到簡單的問題，可以稍微改變一下色譜條件即可，但遇到難的，真得是絞盡腦汁啊。因此，在方法開發或優化中，改善分離是跟我們分析人員息息相關的。改善分離的方式有多種，如調節流速、調節流動相比例、調節流動相組分、調節柱溫、調節梯度、更換色譜柱等等。本文通過自己的切身案例并結合理論談一談利用溶劑的選擇性來改善分離。有時，利用溶劑的選擇性會給你的分離帶來意想不到的驚喜。

案例一

2005年時，我曾經做過一個中成藥的分析，當初是檢測其中君藥當歸中的主成份阿魏酸含量。中成藥組方分為君藥、臣藥、佐藥和使藥，測定含量時一般測定其中的君藥含量即可。中成藥組分復雜，一般由好幾味藥材組成，而一味藥材中又有很多種組分。中成藥相當于復方制劑（幾十種成分），因此不像化藥那樣需要檢查有關物質，無法檢查。中成藥含量測定的色譜圖中，多種組分的色譜峰林立，主峰與相鄰組分峰的分離可以說是見縫插針。該中成藥中的君藥含量測定，需要經過一系列的樣品處理，索氏提取、氯仿萃取、揮干氯仿、溶劑復溶、過濾進樣，這個過程一是為了提取主成分阿魏酸，二是為了除去其他藥材組分以免干擾主成分測定。

進樣后，發現色譜圖中主峰附近有一雜峰挨得很近，應該算是肩峰，使得主峰無法準確積分。當初我還只是個助手，就跟著組長做實驗。為了解決這個問題，她有兩種方案，一是優化色譜條件改善分離，二是優化樣品處理將這雜峰除去。優化色譜條件方面，經過一系列的改變流動相比例、更換色譜柱、調節柱溫、甚至等度改成了梯度，該雜峰卻始終與主峰形影相隨，有分離跡像的也達不到基線分離。優化樣品處理方面，樣品重新處理了好幾回，甚至嘗試了將樣品溶液過柱子，該雜峰依舊存在。

經過一番折騰后無果，組長甚是著急。我當時剛剛畢業兩年，初生牛犢不怕虎，大學里曾經學過的分析化學還記憶猶新。這本分析化學教材是供藥學類專業用，由孫毓慶老師主編的。目前藥學專業的學生，應該還在用此教材吧，只是改版過了。其中在“高效液相色譜”章節中提到了用溶劑系統的四面體優化法來優化流動相。這部分內容有些復雜，在此我只作簡單介紹，具體的大家如有興趣可以再去回爐一下。該四面體由三個不同組別的純溶劑（MEOH、CH3CN、THF）與底劑（H2O）組成正四面體。

四面體優化步驟為：

（1） 根據色譜類型（正、反相），按上述說明組成溶劑四面體，如下圖；

（2） 尋找被分離組分的容量因子k≈3的等洗脫強度面ΔABC，如下圖四面體中心的小三角形，在此面上的任一配比的溶劑洗脫強度都相等；

（3） 將此等洗脫面視為正三角形，按各個比例配制若干個二元、三元和四元初試溶劑；

（4） 用上述初試溶劑作流動相，進樣，檢查分離效果，從中擇優選取。

這種四面體優化方法比較復雜，工作量大，實際工作中很少有這么干的，我們一般根據溶劑的洗脫強度因子，按照一定的比例去調節，這樣操作簡單。當然，近些年來計算機技術和軟件技術的快速發展，據說可以通過簡單幾個實驗就可以模擬篩選進行方法開發最終選出最優方法。上述是穿插的一些分析理論，言回上文案例。我當初對這些理論還有印象，于是在組長下班后就試著去嘗試一下。原來的流動相是乙腈-緩沖溶液，我根據溶劑的洗脫能力在該流動相中添加了一定比例的甲醇并同時調節整個有機相比例，結果讓人驚喜，主峰與雜峰完全達到了基線分離，而且保留時間跟以前基本一致，這樣組分既分開了又沒有改變分析時長。當然，分離是首要目標，不用過多關注分析時長，只要不離譜就行。這件事情，當初真讓我小小激動了一把，有些成就感，又解了組長的燃眉之急，組長心里也高興。此案例，正是利用提高流動相的選擇性而改善分離。

案例二

這是一個化藥緩釋制劑，處方工藝開發接近尾聲時，在溶出曲線日常檢測過程中，發現一個棘手的事情。色譜條件是乙腈-pH2.0緩沖溶液，等度洗脫，色譜柱是某品牌的耐酸性色譜柱。每天溶出曲線樣品量大，同時有四根這樣的色譜柱投入使用，色譜柱使用了一年多基本保持較好的性能。但在這之后，短短一個月之內，這四根柱子先后“掛掉”，主峰與其后的輔料峰達不到基線分離，導致主峰無法準確積分。遂將這四根柱子沖洗再生，接上再試仍然分不開。查看柱效，的確較新啟用時有較大的下降，因此判斷色譜柱壽命差不多了該報廢了。重新啟用了兩根新的同型號色譜柱，進樣分析，分離度達3.5。但好景不長，這兩根色譜柱竟然僅僅使用一周就不行了，主峰與其后輔料峰越來越近，到最后一半峰重疊了。主峰不能準確積分，大量樣品的溶出數據不可靠，分析不能給制劑提供可靠的結果。制劑那邊正在進行處方工藝的DOE，樣品量大，而分析這邊由于分離異常問題不能檢測樣品，再次請購色譜柱需要時間，再說即使新的色譜柱到貨，我們也不能原因未查明的情況下貿然檢測樣品，畢竟這種色譜柱也好幾千一根哪。大量樣品積壓，大家心里都是萬分著急。

怎么辦？當初我仔細比較了這后兩根色譜柱和前面曾用過一年多的色譜柱，發現它們不是同一批的，因此我懷疑可能是這批色譜柱的填料有問題。優化色譜條件？當初真是十萬個不情愿，因為這個方法是試行標準中的方法，且該項目都快交接工藝和轉移分析方法了。嘗試一下吧，眼前積壓的樣品正嗷嗷待哺呢。我仔細分析了一下這一個月前后的色譜圖，發現雖然主峰與其后的輔料峰分離度在逐漸減小，但主峰的柱效基本保持與新柱一樣較高的塔板數，柱效沒變而分離度在下降，我猜測應該是色譜柱的選擇性下降了。靈機一動，雖然固定相的選擇性下降，但可以通過調節流動相的選擇性來改善分離。因此，立刻在原來的流動相基礎上加入一定比例的甲醇，同時調節整個有機相比例以維持主峰的保留時間。結果大快人心，主峰與其后的輔料峰的分離度達到了7.0，足足是新啟用色譜柱的兩倍多，而且保留時間與原來條件相差不多（溶出樣品量大，分析時長要盡量簡短才能高通量進樣）。不光這樣，而且那些用過一年多，柱效已經較低的四根“掛掉”的柱子在新條件下也能達到7.0的分離度，這些柱子又可以重新使用而不至于浪費。該方法后來經過大量樣品的進樣考驗，分離度毫無減小的趨勢。

思考

上述兩個案例都是充分利用了溶劑的選擇性來改善分離，效果顯著。在藥典標準中，也有很多這樣多組分混用的例子，比如USP中的卡培他濱，其中的雜質A和雜質B如不利用這個原理是相當難以分離的。正相色譜中也有好多這樣例子，在此不再列舉。薄層色譜中的展開劑也是利用溶劑的選擇性來改善分離，讓各物質斑點有不同的比移值而錯開。那么，色譜分析中為何可以利用溶劑的選擇性來改善分離呢，我們可以從色譜理論中的分離度方程來解析，這個方程在一般色譜書籍包括我們的分析化學教材里都能找到。下列方程一是分離度方程，從這個方程中，可以看到要提高分離度，主要是通過提高柱效n和選擇性系數α以及容量因子k來實現。為了方便理解，將方程式轉化成第二個方程，這樣我們可以看出，如增大α，則1/α減小，1-1/α增大，分離度R增大。

結語

本文通過親身經歷的兩個經典案例，結合色譜分析理論，解析了利用溶劑的選擇性來改善分離。這兩個案例也讓我真真切切地體會到液相色譜中溶劑選擇性對分離的重要性，大家在實驗時如碰到類似問題可以借鑒或有所啟發。當然，甲醇或四氫呋喃的加入，一定會或多或少地增大基線噪音，但相對于收益來說可以忽略?；A理論讓人感到晦澀難懂，但我們在實驗中，還是要注意理論聯系實際，用理論來武裝自己，善于思考，那些疑難雜癥或許就能迎刃而解。本文僅代表個人觀點，如有不當之處，還望各位同仁多多包涵，亦或是拋磚引玉吧。