蛋白質(zhì)在組織或細(xì)胞中一般都是以復(fù)雜的混合物形式存在,每種類型的細(xì)胞都含有上千中不同的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)的分離和提純工作是一項(xiàng)艱巨而繁重的任務(wù),到目前為止,還沒有一個單獨(dú)的或一套現(xiàn)成的方法能把任何一種蛋白質(zhì)從復(fù)雜的混合物中提取出來,但對任何一種蛋白質(zhì)都有可能選擇一套適當(dāng)?shù)姆蛛x提純程序來獲得高純度的制品。

蛋白質(zhì)提純的總目標(biāo)是設(shè)法增加制品純度或比活性,對純化的要求是以合理的效率、速度、收率和純度,將需要蛋白質(zhì)從細(xì)胞的全部其他成分特別是不想要的雜蛋白中分離出來,同時仍保留有這種多肽的生物學(xué)活性和化學(xué)完整性。

蛋白質(zhì)分離純化的一般程序可分為以下幾個步驟:

1、材料的預(yù)處理及細(xì)胞破碎

分離提純某一種蛋白質(zhì)時,首先要把蛋白質(zhì)從組織或細(xì)胞中稀釋出來并保持原來的天然狀態(tài),不喪失活性。所以要采用適當(dāng)?shù)姆椒▽⒔M織和細(xì)胞破碎。常用的破碎組織細(xì)胞的方法有:

(1)機(jī)械破碎法

這種方法是利用機(jī)械力的剪切作用,使細(xì)胞破碎。常用設(shè)備有,高速組織搗碎機(jī)、勻漿器、研缽等。

(2)滲透破碎法

這種方法是在低滲條件下使細(xì)胞溶脹而破碎。

(3)反復(fù)凍融法

生物組織經(jīng)凍結(jié)后,細(xì)胞內(nèi)液結(jié)冰膨脹而使細(xì)胞脹破。這種方法簡單方便,但要注意那些對溫度變化敏感的蛋白質(zhì)不宜采用此法。

(4)超聲波法

使用超聲波震蕩器使細(xì)胞膜上所受張力不均而使細(xì)胞破碎。

(5)酶法

如用溶菌酶破壞微生物細(xì)胞等。

2、蛋白質(zhì)的抽提

通常選擇適當(dāng)?shù)木彌_液溶劑把蛋白質(zhì)提取出來。抽提所用緩沖液的pH、離子強(qiáng)度、組成成分等條件的選擇應(yīng)根據(jù)欲制備的蛋白質(zhì)的性質(zhì)而定。如膜蛋白的抽提,抽提緩沖液中一般要加入表面活性劑(十二烷基磺酸鈉、triton X-100等),使膜結(jié)構(gòu)破壞,利于蛋白質(zhì)與膜分離。在抽提過程中,應(yīng)注意溫度,避免劇烈攪拌等,以防止蛋白質(zhì)的變性。

3、蛋白質(zhì)粗制品的獲得

選用適當(dāng)?shù)姆椒▽⑺牡鞍踪|(zhì)與其它雜蛋白分離開來。比較方便的有效方法是根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度的差異進(jìn)行的分離。常用的有下列幾種方法。

(1)等電點(diǎn)沉淀法

不同蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)不同,可用等電點(diǎn)沉淀法使它們相互分離。

(2)鹽析法

不同蛋白質(zhì)鹽析所需要的鹽飽和度不同,所以可通過調(diào)節(jié)鹽濃度將目的蛋白沉淀析出。被鹽析沉淀下來的蛋白質(zhì)仍保持其天然性質(zhì),并能再度溶解而不變性。

(3)有機(jī)溶劑沉淀法

中性有機(jī)溶劑如乙醇、丙酮,它們的介電常數(shù)比水低。能使大多數(shù)球狀蛋白質(zhì)在水溶液中的溶解度降低,進(jìn)而從溶液中沉淀出來,因此可用來沉淀蛋白質(zhì)。此外,有機(jī)溶劑會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,促使蛋白質(zhì)分子變得不穩(wěn)定而析出。由于有機(jī)溶劑會使蛋白質(zhì)變性,使用該法時,要注意在低溫下操作,選擇合適的有機(jī)溶劑濃度。

4、樣品的進(jìn)一步分離純化

用等電點(diǎn)沉淀法、鹽析法所得到的蛋白質(zhì)一般含有其他蛋白質(zhì)雜質(zhì),須進(jìn)一步分離提純才能得到有一定純度的樣品。常用的純化方法有:凝膠過濾層析、離子交換纖維素層析、親和層析等等。

有時還需要這幾種方法聯(lián)合使用才能得到較高純度的蛋白質(zhì)樣品。

5、紫外吸收法測蛋白質(zhì)含量

蛋白質(zhì)分子中,酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白質(zhì)具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收高峰在280nm處,其吸光度(即光密度值)與蛋白質(zhì)含量成正比。利用一定波長下,蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與蛋白質(zhì)濃度的正比關(guān)系,可以進(jìn)行蛋白質(zhì)含量的測定。紫外吸收法簡便、靈敏、快速、不消耗樣品,測定后仍能回收使用。低濃度的鹽,例如生化制備中常用的(NH4)2SO4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測,因?yàn)榇藭r只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化,而不需知道其絕對值。

此法的特點(diǎn)是測定蛋白質(zhì)含量的準(zhǔn)確度較差,干擾物質(zhì)多,在用標(biāo)準(zhǔn)曲線測定蛋白質(zhì)含量時,對那些與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì),有一定的誤差。故該法適于用測定與標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì),會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表,再進(jìn)行計算的方法,加以適當(dāng)?shù)男Ｕ５且驗(yàn)椴煌牡鞍踪|(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的,雖然經(jīng)過校正,測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。

此外,進(jìn)行紫外吸收法測定時,由于蛋白質(zhì)吸收高峰常因pH的改變而有變化,因此要注意溶液的pH值,測定樣品時的pH要與測定標(biāo)準(zhǔn)曲線的pH相一致。