一、取樣準(zhǔn)備

 

1. 取樣時(shí)該樣品必須能代表該批產(chǎn)品的情況。

 

從車間取回的冷凍樣品需按要求進(jìn)行解凍，干燥樣品可放在常溫冷暗處，易腐或冷卻樣品應(yīng)放入10℃環(huán)境。冷凍樣品來不及檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)放入-15℃以下冰箱內(nèi)，待檢樣品存放時(shí)間不應(yīng)超過36h。

 

2. 解凍

 

原則上冷凍樣品取出后，應(yīng)按包裝原樣在室溫下自然解凍；也可在0-4℃環(huán)境解凍，時(shí)間不超過18小時(shí)；或在溫度不超過45℃環(huán)境中解凍，時(shí)間不超過15min。如果這些解凍條件對(duì)大塊冷凍品達(dá)不到解凍的目的，可參照以下解凍條件：

 

（1）100-300g調(diào)理食品45℃解凍10min左右；

 

（2）500g以下冷凍蔬菜30℃解凍40min左右；

 

（3）500g以上冷凍樣品37℃解凍1h左右；室溫下解凍2h左右。

 

備注：將樣品解凍到半解凍狀態(tài)（用剪刀能剪開的程度）。

 

3. 操作環(huán)境

 

試驗(yàn)前用臭氧發(fā)生器/紫外線將工器具、無菌間滅菌消毒，達(dá)到無菌狀態(tài)。

 

檢查操作試驗(yàn)的準(zhǔn)備物品均質(zhì)袋、酒精及酒精棉、吸管、平皿、稀釋液、剪刀、鑷子、無菌盆等是否齊全。

 

二、取樣及樣液制備

 

1. 樣品標(biāo)識(shí)

 

將樣品按污染程度低到污染程度高的順序排列，相應(yīng)的作對(duì)應(yīng)性標(biāo)識(shí)按細(xì)菌數(shù)平皿、大腸菌群平皿、金黃色葡萄球菌平皿的順序，2-3個(gè)樣品一摞。如圖1：

 

圖1

 

2. 檢樣采取

 

先將樣品外包裝正反面用酒精噴灑（如果樣品表面有冷凝水需擦拭干凈后再用酒精噴灑），如圖2：

 

圖2

 

（1）固體樣品

 

①開啟部位及其周圍用75%酒精棉消毒，再用火焰滅菌的剪刀剪開，如圖3。

 

圖3

 

②在電子稱上放入無菌均質(zhì)袋（手不要碰及袋口）去皮調(diào)整至零，如圖4。

 

圖4

 

③用火焰滅菌后的剪刀和鑷子取樣，稱取25g有代表性樣品，如圖5、6、7、8、9。

 

圖5                             圖6

 

 

圖7                                         圖8

 

圖9

 

④加入225mL滅菌磷酸鹽緩沖液（開蓋時(shí)瓶口部和瓶塞應(yīng)在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入的雜菌）后，均質(zhì)或待均質(zhì)，如圖10、11、12。

 

圖10

 

圖11                                           圖12

 

⑤將剪刀鑷子擦拭干凈后浸泡于75%酒精容器中并將樣品封口。

 

⑥將袋子折疊后用拍擊式均質(zhì)器均質(zhì)約30秒作為樣液，此時(shí)均質(zhì)袋內(nèi)要設(shè)定為不含空氣（可根據(jù)樣品不同情況相應(yīng)調(diào)整均質(zhì)時(shí)間），如圖13、14。

 

   圖13                                             圖14

 

（2）液體樣品

 

①冷凍樣品需完全解凍。

 

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，用滅菌吸管取充分混合后樣25mL。

 

③余同固體樣品處理方法。

 

(3) 粉末狀樣品以及半固體樣品

 

①將樣品混合均一化。

 

②75%酒精棉消毒開啟部位及其周圍，再用火焰滅菌的剪刀開啟，以無菌匙采取混合后樣10g。

 

③加入90mL滅菌磷酸鹽緩沖液，開蓋瓶塞時(shí)瓶口部和瓶塞應(yīng)在火焰通過1-2次，以殺滅從空氣中落入雜菌。

 

④余同固體樣品處理方法。

 

※ 備注：

 

a. 從罐頭取樣時(shí)，在表面放上小塊酒精棉（倒上少量酒精）點(diǎn)火燃燒后開罐。罐頭起子用酒精棉擦拭火焰滅菌后使用。

 

b. 75%酒精必須保證一周換3次，如果容器內(nèi)有明顯的污物應(yīng)立即更換。

 

c. 火焰滅菌的剪刀、鑷子通過火焰4-5s即可。

 

三、稀釋方法

 

①?gòu)木|(zhì)袋準(zhǔn)確吸取樣液1mL，如圖15。

 

 

圖15

 

②沿管壁徐徐接種到含9mL磷酸鹽緩沖液里，蓋上試管塞后充分震蕩混勻?yàn)?：100稀釋液。（勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，以免吸管外部粘附的檢液溶于其內(nèi)。）

 

③重復(fù)該操作，按需要配制1：1000、1：10000…稀釋液。

 

④為減少樣品稀釋誤差，在連續(xù)遞增稀釋時(shí)（原液在前稀釋液在后），每一稀釋液應(yīng)充分振搖，使其均勻，同時(shí)每一稀釋度應(yīng)更換一支吸管。

 

⑤不要在稀釋劑中吹洗吸管。

 

※ 備注：

 

a. 樣液稀釋必須加以足夠震搖，確保液體混勻，形成的菌落能以10倍遞增或遞減，符合邏輯性。

 

b. 車間產(chǎn)品根據(jù)加工工藝或?qū)ξ廴厩闆r的估計(jì)選擇合適的稀釋倍。（尤其注意蔥、姜、蒜等無加熱類產(chǎn)品、保存實(shí)驗(yàn)、外調(diào)新廠家、樣品開發(fā)、原料等樣品）。

 

四、樣液接種方法：

 

1. 從吸管筒沿筒上壁抽出吸管，在火焰旁吹洗吸耳球同時(shí)在吸管尾端插上吸耳球后，從吸管尾端至尖端快速通過火焰，并且排空吸管里殘留的水，如圖16、17、18。

 

圖16                                      圖17

 

 

圖18

 

2. 以吸管插入均質(zhì)袋樣液內(nèi)的深度不超過2.5cm處，準(zhǔn)確吸取樣品勻液（吸管尖不要碰著袋口。吸入的液體應(yīng)先高于所要求的刻度, 然后提起吸管使其尖端離開液面并貼在袋內(nèi)將液體調(diào)至所要求的刻度。）1mL、1mL、1mL、0.2mL保持無菌操作并在2～4s內(nèi)注入已標(biāo)識(shí)清楚的細(xì)菌數(shù)、大腸菌群、EC以及金黃色葡萄球菌平皿中（EC接種后應(yīng)迅速震蕩均勻），如圖19、20、21、22。

 圖19                                    圖20

 

圖21                                       圖22

 

3. 如果某一樣品液在接種前放置時(shí)間超過3 min，應(yīng)重新均質(zhì)。

 

4. 為了驗(yàn)證稀釋液、培養(yǎng)基、平皿、吸管等是無菌的，需做空白對(duì)照。

 

五、傾注倒藥方法

 

右手持有培養(yǎng)基的三角瓶（已放50-60℃的水浴中恒溫）置火焰旁邊，用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫，迅速倒人培養(yǎng)基約15mL，加蓋后輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布在培養(yǎng)皿底部，然后平置于桌面上；也可將平皿放在火焰附近的桌面上用左手的拇指和食指打開培養(yǎng)皿，再注入培養(yǎng)基，搖勻，如圖23、24、25。

 

  圖23                                 圖24

 

圖25

 

※備注：

 

a. 培養(yǎng)基在50-60℃水浴中的保溫時(shí)間不要超過4h。

 

b. 從采樣開始到分注培養(yǎng)基操作限于20min以內(nèi)。

 

c. 涂布的平皿表面需干燥（干燥不充分易發(fā)生菌落擴(kuò)散，有冷凝水不利于細(xì)菌分離并且會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌繁殖使結(jié)果失真；干燥過分，會(huì)導(dǎo)致培養(yǎng)基裂開，不能用；干燥合適，則樣液吸收完全、快）。

 

d. 細(xì)菌容易吸附在玻璃器皿的表面，所以菌液注入平皿后應(yīng)盡快將平皿內(nèi)的樣液和瓊脂培養(yǎng)基充分混合，否則細(xì)菌不容易分散。混合方法是將平皿傾斜和旋轉(zhuǎn)使之充分混合，但要注意不要讓培養(yǎng)基從培養(yǎng)皿內(nèi)溢出，且不要粘附在平皿壁和蓋上。

 

六、培養(yǎng)

 

1. 平皿倒置放入恒溫培養(yǎng)箱中(每垛最多堆放6個(gè)平皿，平皿間要留有空隙進(jìn)行空氣流通，使培養(yǎng)物的溫度盡快與培養(yǎng)箱溫度達(dá)到一致)，按所規(guī)定的時(shí)間溫度進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)箱應(yīng)保持一定的濕度,經(jīng)48h培養(yǎng)的瓊脂培養(yǎng)基的失重不得超過15％，如圖26。

 

圖26

 

2. 斜面、高層斜面、液體培養(yǎng)基立在試管架上放入恒溫培養(yǎng)箱中，按所規(guī)定的時(shí)間溫度進(jìn)行培養(yǎng)，如圖27。

 

圖27

 

七、計(jì)數(shù)判定及注意事項(xiàng)

 

1. 由于細(xì)菌種類繁多，差別甚大。計(jì)數(shù)時(shí)一般用透射光于平皿背面或正面（菌落計(jì)數(shù)器）仔細(xì)觀察。必要時(shí)用放大鏡檢查，以防遺漏尤其是平皿邊緣生長(zhǎng)的菌落。

 

2. 計(jì)數(shù)方法參照SN/T 0168-2015方法。

 

3. 稀釋度低的培養(yǎng)皿，微生物菌落和食品碎渣很難區(qū)分，一般以食品碎渣沒有光澤，不夠光滑來識(shí)別。

 

4. 為了避免食品中的微小顆?；蚺嗷械碾s質(zhì)與細(xì)菌菌落發(fā)生混淆，不易分辨，可同時(shí)作一稀釋液與瓊脂培基混合的平板，不經(jīng)培養(yǎng)，而于4℃環(huán)境中放置，以便計(jì)數(shù)時(shí)作對(duì)照觀察。

 

5. 必要時(shí)，為了防止食品顆粒與菌落混淆不清，可在平板計(jì)數(shù)瓊脂中加入氯化三苯四氮唑TTC（100mL加入1mL0.5%TTC），培養(yǎng)后菌落呈紅色，易于分別。

 

6. 在發(fā)酵試驗(yàn)中，發(fā)酵倒管的產(chǎn)氣量，多者可以使發(fā)酵倒管全部充滿氣體，少者可以產(chǎn)生比小米粒還小的氣泡，或發(fā)酵時(shí)產(chǎn)酸或沿管壁有緩緩上浮的小氣泡，都應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。如果對(duì)產(chǎn)酸但未產(chǎn)氣的發(fā)酵有疑問時(shí)，可以用手輕輕打動(dòng)試管，如有氣泡沿管壁上浮，就像啤酒中的二氧化碳?xì)馀菀粯?，即?yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，而應(yīng)作進(jìn)一步試驗(yàn)。如果只是搖起的氣泡，就是陰性。