1分離度定義

在HPLC或者GC色譜中，分離度用以衡量相鄰洗脫組分的分離情況，是將色譜柱分離效率與流動相效率綜合在一起的一個參數(shù)，分離度越大，相鄰兩組分分離地越好。一般地，分離度小于1時，兩色譜峰重疊較嚴(yán)重；分離度等于1(4σ)時，兩組分被徹底分離部分占98%，對每個色譜峰來說，其峰純度亦為98%；分離度為1.5(6σ)時，兩組分被徹底分離部分占99.7%，通常以R=1.5作為相鄰兩組分完全分離的標(biāo)志。對于色譜峰積分面積比為1：1的兩組分的分離情況與分離度的關(guān)系，如下圖1A與1B所示。

1.1.分離度的計算

對于分離度的計算有以下幾種方法：

(1)利用保留時間以及基線峰寬，按照下式1進行計算；

(2)利用保留時間以及半峰寬，按照下式2進行計算；

各參數(shù)意義詳見下圖2所示。

(3)利用色譜柱柱效(N)，分離因子(α)以及保留時間較長的組分的容量因子(K)，按照下式2進行計算；

上述三個公式，理論上都可以對分離度進行計算，但公式3需要得到色譜柱的柱效，而對色譜柱而言，針對不同的化合物其柱效是不一樣的，盡管儀器操作條件完全相同。因此，該式更多應(yīng)用于理論推導(dǎo)。

上述公式1與公式2則更多應(yīng)用于實際色譜圖中相鄰洗脫組分色譜峰分離度的計算。對于公式1，其應(yīng)用范圍是兩色譜峰基本基線分離及其以上的情況，因為該式需要測定明確的基線峰寬；當(dāng)基線峰寬不能明確測量時(如兩相鄰組分色譜峰重疊處峰谷高度與較低色譜峰高度比值小于50%時，如圖3所示)，則比較適宜選擇公式2計算分離度，因為該式測量的是半峰高處的峰寬。

1.2.峰高比法預(yù)測分離度

公式1以及公式2可解決基線分離以及色譜峰重疊處峰谷高度與較低色譜峰高度比值小于50%時，對于兩相鄰色譜峰分離度的計算需求。當(dāng)兩相鄰組分色譜峰重疊處峰谷高度與較低色譜峰高度比值大于50%時(如圖4所示)，由于無法精確測量基線峰寬以及半峰高峰寬，使用公式1以及公式2計算分離度受到很大程度的限制。

如圖4所示，關(guān)鍵色譜峰對A，B，C色譜峰重疊處峰谷高度與較低色譜峰高度之間比值超過50%，無法精確測量基線峰寬以及半峰高處峰寬，這也是一些計算機數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)無法給出一些關(guān)鍵峰對分離度的原因。

從理論上講，組分經(jīng)色譜柱分離之后被檢測器檢測到的信號強度分布在時間軸是高斯分布(正態(tài)分布)的，經(jīng)由計算機結(jié)合色譜分離塔板理論對相鄰組分的分離色譜圖進行模擬(如下圖5A及5B所示)。

將分離度大小(經(jīng)由公式1或公式2計算得到)與兩色譜峰峰高以及色譜峰重疊處峰谷高度與較低色譜峰高度之間比值進行關(guān)聯(lián)，得到分離度與峰高比關(guān)系表(表1)，用于對重疊色譜峰分離度進行預(yù)測。

當(dāng)然上述表格中預(yù)測方法也存在局限性，當(dāng)兩色譜峰重疊處峰谷高度與較低色譜峰高度之間比值大于90%時，由于兩色譜峰嚴(yán)重重疊，兩重疊色譜峰各自峰高均大于單獨峰高(圖5B，A)，此外當(dāng)兩重疊色譜峰高度比大于100時，峰高大的色譜峰幾乎將小的色譜峰完全覆蓋(圖5B，C)，此時使用該方法得到的分離度顯然是不符合實際情況的。

2影響分離度因素

多種因素可影響分離度的大小，其中為大家所熟知的是色譜柱的柱效，流動相的選擇以及溫度，流速等。此外，色譜峰的峰形，峰寬以及檢測器相關(guān)參數(shù)的設(shè)置亦會影響分離度的大小。

2.1.色譜峰峰形與峰寬對分離度的影響

由檢測器實際檢測到的經(jīng)由色譜柱流出組分的濃度響應(yīng)信號強度，大多數(shù)情況下不是標(biāo)準(zhǔn)的高斯分布輪廓，可以色譜峰不對稱因子以及色譜峰拖尾因子對色譜峰的峰形進行評價。不對稱因子可按照As=B/A計算得到，其中B為10%峰高處后半部分色譜峰的峰寬，A為前半部分峰寬(如圖6A所示)；拖尾因子可按照Tf=C/2D計算得到，其中C為5%峰高處峰寬，D為色譜峰前半部分峰寬(如圖6B所示)。

一般地，不對稱因子要≥拖尾因子，二者相對大小如下表2所述。

拖尾因子對于分離度的影響如下圖7所示，隨第一個色譜峰拖尾因子的增加，兩色譜峰之間的分離度減小。

對于兩個拖尾因子均為1.0的色譜峰來說，在不超載的情況下色譜峰的高度與色譜峰的寬度是相互獨立的，而對于拖尾比較嚴(yán)重的色譜峰來說，色譜峰越高，其拖尾越嚴(yán)重，其色譜峰寬度越大，進而導(dǎo)致兩色譜峰之間分離度降低(如圖8所示)。

此外，無論是采取公式1，公式2計算還是采用色譜峰重疊處峰谷高度與較低色譜峰高度比值進行預(yù)測分離度，均無法避免拖尾因子對于分離度的影響。值得注意的是，拖尾因子較大導(dǎo)致分離度減小，一般只發(fā)生在前一色譜峰拖尾的情況，后一色譜峰拖尾對于分離度幾乎無影響或影響很小(如圖9所示)。

因此在對含有可游離基團化合物的分析時，通過調(diào)整pH改變色譜峰的出峰順序，對于改善分離度是有裨益的。

2.2.DAD檢測器采樣頻率對分離度的影響

用于精確定量的色譜分析方法，每個色譜峰需要20-25個點，采樣頻率的大小不僅影響色譜方法定量的準(zhǔn)確性，也影響色譜峰之間的表觀分離度，如下圖10所示。

如上圖所示，當(dāng)由于采樣頻率引起色譜峰分離度較差，可適當(dāng)增大采樣頻率來改善這種狀況(如果色譜柱本身無法做到對待分離組分有效分離，該方法并無裨益)。

分離度可以按照保留時間，峰寬以及半峰寬計算，亦可以色譜柱柱效以及容量因子計算。此外也可以根據(jù)重疊兩色譜峰的峰高比以及重疊處峰谷與較低色譜峰峰高比來預(yù)測分離度。無論采取哪種方式，均具有局限性，在實際情況下，需要根據(jù)相鄰色譜峰的分離情況做出選擇。此外，色譜峰拖尾因子以及檢測器相關(guān)設(shè)置對于分離度的影響亦不容忽視。