概述

鹵代烷烴是藥物合成反應中使用非常廣泛的烷基化試劑，例如鹽酸非索非那定和米拉美林合成工藝中使用碘甲烷作為烷基化試劑、4-氯甲基-5-甲基-1,3-二氧雜環戊烯-2-酮是奧美沙坦酯合成中用到的一個關鍵起始物料。2006年EMEA頒布的《遺傳毒性雜質限度指導原則》和FDA發布的《原料藥和制劑中的基因毒性和遺傳毒性雜質：推薦方法》中都有提到，由于鹵代烷烴的反應活性很活潑，通過親電取代反應，能夠與生物活性大分子（如DNAs、RNAs和蛋白質）直接發生烷基化反應，或鹵代烷烴可以在光照或其他激發能量作用下產生自由基，這兩種方式都對DNA進行直接或間接作用，可能會導致DNA突變，與這類試劑接觸可能存在一些致癌風險，嚴重危害人類健康。

鹵代烷烴在藥物合成中大量使用，結構種類繁多，是基因毒性雜質中最為多見的一類。鹵代烷烴，單鹵代烯烴，氮芥，硫芥是典型的遺傳毒性致癌性物的警示結構（如圖1），其中氯甲烷、氯乙烷已被證實為是已知的基因毒性雜質。藥品合成中產生的鹵代烷烴中間體或雜質是否為基因毒性雜質是現階段藥物研究過程中重要討論和控制的內容，也已成為國內外藥品注冊審評不可缺少的項目，因此根據不同鹵代烷烴雜質的性質，需要在藥品中建立相應的檢測方法對其進行控制。

圖1.鹵代烷烴化合物結構圖

根據參考各國藥典及文獻，總結了部分含有鹵代烷烴類基因毒雜質藥物的種類，詳見表1。

表1. 含有酰氯類基因毒雜質藥物列表

常用檢測方法

直接檢測法：

對于具有揮發性的鹵代烷烴，如鹵代甲烷、鹵代乙烷和鹵代丙烷，因其具有很強的揮發性，所以氣相色譜法是此類基因毒雜質的主要分析手段。因一般常用的氫火焰離子化檢測器（FID）的靈敏度較低，故多采用電子捕獲檢測器（ECD）作為檢測手段并結合頂空進樣（HS）的方式來測定藥物中揮發性鹵代烴。有文獻顯示，相同濃度下的短鏈鹵代烷烴中，碘代烷烴的靈敏度最高，氯代烷烴的靈敏度最低，同時含有多個氯原子或者溴原子的烷烴也具有很高的靈敏度。因此，ECD檢測器更適用于測定含溴和含碘的烷烴化合物，尤其是含有多個鹵原子的烷烴，而對于只含有一個氯原子的烷烴化合物，一般采用靈敏度更高的氣質聯用技術GC-MS進行測定。

對于非揮發性的鹵代烷烴，HPLC-UV是藥物分析中最常用的分離檢測手段，該法適合于具有紫外吸收的鹵代烷烴，由于基因毒檢測是痕量檢測，故HPLC的檢測靈敏度就相對較低。而對于含N的鹵代化合物，常采用液質聯用技術（LC-MS）法進行測定，以達到提高檢測靈敏度的目的。

衍生化法：

當樣品不能直接進樣分析時，為了滿足分析方法的要求，同時也能夠提高鹵代烷烴的檢測靈敏度，通常會選擇柱前衍生的方法進行檢測。據文獻報道，用4-二甲氨基吡啶和1-（4-吡啶基）哌啶-4-甲酸正丁酯作為衍生化試劑，采用HILIC-MS/MS（親水相互作用色譜）及CE-MS（毛細管電泳法）測定鹵代烷烴，雖靈敏度可以達到，但都存在衍生化時間較長的問題。而采用二甲胺、三甲胺為衍生化試劑時，不僅能避免原料藥和其他物質的干擾，且反應簡單快速，還能夠達到很高的檢測靈敏度（LOD能夠達到ng級）。除此之外，還有采用3-碘苯甲酰氯為衍生化試劑，采用LC-ICP-MS（電感耦合等離子體）來測定藥物中基因毒雜質4-氯1-丁醇，其LOQ能夠達到1.25ng/mL。

以下兩個案例可供借鑒

雙丙戊酸鈉：

雙丙戊酸鈉（Divalproex sodium，化合物1，圖2），是新一代丙戊酸類衍生物，是一種新型廣譜低毒抗癲癇藥物。在雙丙戊酸鈉的合成工藝（圖2）中，一般以丙二酸二乙酯作為起始原料，在乙醇鈉溶液中，滴加1-溴丙烷試劑進行縮合反應，得到中間體4，然后在酸性條件下水解，得到中間體5，之后在180℃減壓蒸餾3 h，脫羧得到中間體6，最后滴加NaOH溶液攪拌反應制得雙丙戊酸鈉成品。雙丙戊酸鈉的合成工藝中使用到的1-溴丙烷試劑（化合物3，圖2），其結構與已知基因毒性雜質結構類似，具有警示結構，因此必須對其嚴格控制，控制其毒理學閾值（TTC）。根據ICH發布基因毒性雜質的最大攝取量為1.5 μg/d計算，雙丙戊酸鈉最大日劑用量為3g/d，則對應的基因毒性雜質1-溴丙烷的TTC水平為0.5ppm。

圖2. 雙丙戊酸鈉的合成工藝

因此，采用GC-MS，頂空進樣的方法測定1-溴丙烷。根據ICH指南要求，對該方法進行了檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、線性、精密度、準確性等相關驗證，1-溴丙烷在0.1ppm~0.75 ppm的范圍內均成良好的線性關系，相關系數R2=0.9999，1-溴丙烷的LOD和LOQ分別能夠達到0.05 ppm及0.1 ppm，平均回收率為97.3%，該方法靈敏度非常高、無干擾且操作簡單，適合在痕量水平下對雙丙戊酸鈉中基因毒雜質1-溴丙烷進行控制。

阿瑞吡坦:

阿瑞吡坦（Aprepitant，化合物7，圖3）是美國Merck公司開發的一個具有全新作用機制的止吐藥，也是由美國FDA于2003年批準上市的第一個神經激肽-1（NK-1）受體阻滯劑。阿瑞吡坦的合成是以(2R,3S)-2-[(1R)-1-[3,5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)嗎啉（化合物8，圖3）為中間體，與另一個中間體2-(2-氯-1-亞乙基)酰肼甲酸甲酯（化合物9，圖3）進行縮合反應得到中間體10，然后中間體10在高溫下環合制備而得到阿瑞吡坦成品。事實上，所用到的中間體2-(2-氯-1-亞乙基)酰肼甲酸甲酯（MIC，化合物9，圖3）已經被證實具有潛在的遺傳毒性和致癌性，因此，依據EMA和FDA相應的指導原則，有必要對阿瑞匹坦中的2-(2-氯-1-亞乙基)酰肼甲酸甲酯的殘留進行定量分析。

圖3. 阿瑞吡坦合成工藝

因此，采用二甲胺為衍生化試劑，將MIC轉化為叔胺類衍生物MDC（如圖4），然后利用LC-MS的方法進行檢測，以0.01M甲酸銨水溶液-甲醇為流動相，在該方法下MIC的LOD和LOQ分別為1.2ppm和4.0ppm，在4.0~15.0 ppm的濃度范圍內均成良好的線性關系，相關系數R2=0.998，回收率為84.8-92.8%。該方法快速、簡單、準確且經全面驗證后符合檢測的需求。

圖4. MIC衍生化反應式

總結

鹵代烷烴類化合物作為潛在的基因毒性雜質，通常作為烷基化試劑存在于藥物合成過程中，這些微量的反應試劑會作為雜質存在于終產品中，可能具有遺傳毒性和致癌性而危害病人的健康。因此，藥品中如果含有上述種類的基因毒性雜質，就需要對其進行嚴格的控制。由于鹵代烷烴類基因毒種類繁多，且化學性質都非?；顫?，因此給分析方法的開發帶來了巨大的挑戰。

基因毒性雜質對藥品質量的影響是不可忽視的，藥品研發人員、生產者應盡可能地明確藥品中各類基因毒雜質的結構、來源、毒性、檢測方法以及質控限度，通過對藥品生產工藝的改進及優化來降低雜質的含量，從起始原料控制、中間過程控制、終產品控制以及流通、貯藏等各個環節保證和提高藥品的質量。在基因毒雜質整個研究過程中，最重要的就是分析方法的開發與驗證，需要從雜質的結構特征、理化性質、劑型特征、工藝過程等各個方面綜合考慮、嚴謹研究、規范驗證。因此，建立一個科學可行的分析方法是基因毒雜質研究與控制的基石。

本文根據以下文章進行編輯整理，僅用于學習、交流：

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