鱟，音[hòu]，sb(horseshoe crab)，屬于蛛形綱 [4] （Arachnida）劍尾目（Xiphosura）的海生節(jié)肢動(dòng)物，鱟形似蟹，身體呈青褐色或暗褐色，包被硬質(zhì)甲殼，有四只眼睛，其中兩只是復(fù)眼 [1] ，頭胸甲前端有0.5毫米的兩只小眼睛，對(duì)紫外光最敏感，只用來(lái)感知亮度，頭胸甲兩側(cè)有一對(duì)大復(fù)眼。雖然鱟可以背朝下拍動(dòng)鰓片以推進(jìn)身體游泳，但通常將身體彎成弓形，鉆入泥中，然后用尾劍和最後一對(duì)步足推動(dòng)身體前進(jìn)。

鱟的祖先出現(xiàn)在地質(zhì)歷史時(shí)期古生代的泥盆紀(jì)，當(dāng)時(shí)恐龍尚未出現(xiàn)，原始魚(yú)類(lèi)剛剛問(wèn)世，隨著時(shí)間的推移，與它同時(shí)代的動(dòng)物或者進(jìn)化、或者滅絕，而惟獨(dú)只有鱟從4 億多年前問(wèn)世至今仍保留其原始而古老的相貌，所以鱟有“活化石”之稱(chēng)。

由于受?chē)?guó)家政策影響，內(nèi)毒素檢測(cè)試劑所用原料鱟（中國(guó)鱟及圓尾鱟）被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物（國(guó)家林業(yè)和草原局、農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2021年2月25日公告（2021年第3號(hào)）），意味著內(nèi)毒素檢測(cè)試劑原料將受到嚴(yán)格管控，目前藥典收錄方法都是以鱟試劑為基礎(chǔ)制定，新方法只能寄希望于藥典委盡快出臺(tái)配套替代方法。

目前國(guó)際上其他新興的細(xì)菌內(nèi)毒素檢測(cè)方法：

1、利用重組技術(shù)人工合成鱟試劑中的關(guān)鍵酶-C 因子來(lái)量化細(xì)菌內(nèi)毒素的重組 C 因子法；

2、仍然使用鱟試劑,但用量?jī)H為原方法的十分之一的微量凝膠法。

法律背景

《中華人民共和國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)法》第二十七條　禁止出售、購(gòu)買(mǎi)、利用國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物及其制品。因科學(xué)研究、人工繁育、公眾展示展演、文物保護(hù)或者其他特殊情況，需要出售、購(gòu)買(mǎi)、利用國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物及其制品的，應(yīng)當(dāng)經(jīng)省、自治區(qū)、直轄市人民政府野生動(dòng)物保護(hù)主管部門(mén)批準(zhǔn)，并按照規(guī)定取得和使用專(zhuān)用標(biāo)識(shí)，保證可追溯，但國(guó)務(wù)院對(duì)批準(zhǔn)機(jī)關(guān)另有規(guī)定的除外。實(shí)行國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物及其制品專(zhuān)用標(biāo)識(shí)的范圍和管理辦法，由國(guó)務(wù)院野生動(dòng)物保護(hù)主管部門(mén)規(guī)定。出售、利用非國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物的，應(yīng)當(dāng)提供狩獵、進(jìn)出口等合法來(lái)源證明。

《中華人民共和國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)法》第三十三條　運(yùn)輸、攜帶、寄遞國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物及其制品、本法第二十八條第二款規(guī)定的野生動(dòng)物及其制品出縣境的，應(yīng)當(dāng)持有或者附有本法第二十一條、第二十五條、第二十七條或者第二十八條規(guī)定的許可證、批準(zhǔn)文件的副本或者專(zhuān)用標(biāo)識(shí)，以及檢疫證明。

第三百四十一條　【非法獵捕、殺害珍貴、瀕危野生動(dòng)物罪】【非法收購(gòu)、運(yùn)輸、出售珍貴、瀕危野生動(dòng)物、珍貴、瀕危野生動(dòng)物制品罪】非法獵捕、殺害國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的珍貴、瀕危野生動(dòng)物的，或者非法收購(gòu)、運(yùn)輸、出售國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的珍貴、瀕危野生動(dòng)物及其制品的，處五年以下有期徒刑或者拘役，并處罰金；情節(jié)嚴(yán)重的，處五年以上十年以下有期徒刑，并處罰金；情節(jié)特別嚴(yán)重的，處十年以上有期徒刑，并處罰金或者沒(méi)收財(cái)產(chǎn)。

那么，首先我們來(lái)看看為啥要把內(nèi)毒素檢測(cè)試劑所用原料鱟（中國(guó)鱟及圓尾鱟）被列為國(guó)家二級(jí)保護(hù)動(dòng)物？

其實(shí)也簡(jiǎn)單，所謂沒(méi)有利益就沒(méi)有傷害！

鱟的歷史可以追溯至古生代的泥盆紀(jì)，那時(shí)，恐龍尚未出現(xiàn)，原始魚(yú)類(lèi)剛剛問(wèn)世。然而，自從鱟被用來(lái)開(kāi)發(fā)檢測(cè)內(nèi)毒素之后，世界各地均出現(xiàn)瘋狂捕撈過(guò)度開(kāi)采的現(xiàn)象。就我國(guó)而言，因索取無(wú)度，才20余年我國(guó)沿海的鱟已從遍布海灘到幾乎絕跡。

內(nèi)毒素檢測(cè)的發(fā)展史

1912年，Hort和Penfold開(kāi)發(fā)并完善了一種兔子動(dòng)物模型，該模型促進(jìn)了注射熱的研究。他們對(duì)兔子模型精心控制了品種、性別、體重、食物和環(huán)境飼養(yǎng)條件。在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中都報(bào)告了劑量。間隔30分鐘進(jìn)行溫度測(cè)量。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)使他們能夠最終證明，當(dāng)使用新鮮蒸餾水進(jìn)行靜脈注射時(shí)，不存在發(fā)燒體（FPB）。Hort和Penfold取消了與以下各項(xiàng)有關(guān)的所有理論：（a）水熱，（b）鹽熱，（c）碳水化合物熱，（d）發(fā)酵熱和（e）組織熱。不幸的是，直到1923年，他們的工作才得到適當(dāng)?shù)恼J(rèn)可。

1923年，F(xiàn)lorence Seibert認(rèn)可了Hort和Penfold進(jìn)行科學(xué)研究的基本價(jià)值。她對(duì)注射熱的研究使用了他們開(kāi)發(fā)的相同的兔子模型。Seibert成功地確認(rèn)并擴(kuò)展了前提條件，即蒸餾水中的熱源材料是細(xì)菌來(lái)源的，并且這些材料不會(huì)通過(guò)過(guò)濾除去。最重要的是，她介紹了“一種制備非熱源水的方法”。她的制備非熱原性蒸餾水的方法包括用堿將連接塞子加熱幾次（去熱原），并在蒸餾瓶上方引入一個(gè)“收集器”。捕集并防止熱原被機(jī)械地帶入餾出物中。

隨著1930年代整個(gè)腸胃外產(chǎn)業(yè)的興起以及二戰(zhàn)之前和二戰(zhàn)期間對(duì)腸胃外解決方案的大量需求，確保商業(yè)腸胃外解決方案不受熱原污染的需求觸發(fā)了美國(guó)藥典（USP）的發(fā)展，熱原體藥典測(cè)試應(yīng)運(yùn)而生。1941年，USP、NIH、FDA和14家制藥公司合作開(kāi)展了熱原測(cè)試的第一項(xiàng)研究。該研究利用了由Hort，Penfold和Siebert開(kāi)發(fā)的兔子模型，合作的結(jié)果導(dǎo)致在1942年的USP第12版中包括了第一個(gè)藥典熱原試驗(yàn)。該試驗(yàn)需要靜脈注射溶液和一組兔子的直腸溫度測(cè)量三個(gè)小時(shí)。

在1964年至1968年期間，Levin和Bang報(bào)道革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素具有凝結(jié)大西洋馬蹄蟹血液的能力。他們確定對(duì)血液中細(xì)菌內(nèi)毒素的敏感性（源自革蘭氏陰性細(xì)菌）是由于其血細(xì)胞，變形細(xì)胞中的酶。由于測(cè)試是基于鱟（血鱟），并且由于所述酶從獲得的鱟細(xì)胞通過(guò)裂解具有高純度的蒸餾水，試驗(yàn)被評(píng)為鱟變形細(xì)胞溶解物，或LAL。Levin and Cooper于1971年發(fā)表的一篇文章報(bào)道說(shuō)，與RPT相比、LAL（鱟試劑）更靈敏且成本更低。它激發(fā)了全世界對(duì)于確定BET作為RPT替代品的適用性的興趣。

1973年，F(xiàn)DA公布了用于生產(chǎn)LAL的擬議生產(chǎn)規(guī)范。LAL的制造商必須在使用前向FDA提交每批樣品以進(jìn)行測(cè)試。臨時(shí)使用LAL可使行業(yè)獲得實(shí)際經(jīng)驗(yàn)。常規(guī)上使用創(chuàng)新的LAL測(cè)試來(lái)測(cè)試原材料，過(guò)程中的樣品，首批（FOB）和批中（MOB）樣品。批次結(jié)束（EOB）樣品需要兔子測(cè)試，因?yàn)镋OB被認(rèn)為是最壞的情況。

最大的醫(yī)療設(shè)備和LVP生產(chǎn)商Baxter Travenol認(rèn)識(shí)到LAL測(cè)試的簡(jiǎn)單性和耐用性，于1973年做出了一項(xiàng)公司決定，將LAL驗(yàn)證為其全球設(shè)施的內(nèi)毒素測(cè)試。在1979年和1982年，他們報(bào)告了其年度內(nèi)毒素檢測(cè)結(jié)果。這些數(shù)據(jù)包括66594 USP兔熱原測(cè)試和356548 LAL測(cè)試。值得注意的是，兩種方法均測(cè)試了404個(gè)自然污染的樣品。LAL測(cè)試確認(rèn)了內(nèi)毒素的存在，所有404個(gè)樣品均未通過(guò)測(cè)試。但是，按照USP第<151>章熱原測(cè)試，對(duì)所有404個(gè)樣品進(jìn)行的八次兔子測(cè)試僅導(dǎo)致19次失敗。這些數(shù)據(jù)明確表明，LAL是更靈敏的方法，革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)毒素是對(duì)腸胃外產(chǎn)品制造影響最大的熱原。這些數(shù)據(jù)和45年的經(jīng)驗(yàn)證明了LAL測(cè)試的特異性（檢測(cè)一系列內(nèi)毒素的能力）。如下表1所示：

內(nèi)毒素檢測(cè)的未來(lái)：

測(cè)量和檢測(cè)居住在純凈水系統(tǒng)中的微生物群落產(chǎn)生的所有內(nèi)毒素的能力（Burkholderiaceae，Methylobacteriaceae，Comamonadaceae類(lèi)/科的成員）對(duì)于WFI系統(tǒng)的操作控制絕對(duì)必要。目前，LAL測(cè)試的重組替代品不能始終如一地做到這一點(diǎn)。必須在重組蛋白質(zhì)化學(xué)或重組制劑方面取得進(jìn)一步進(jìn)展。對(duì)LAL重組替代品的提煉必須考慮對(duì)天然環(huán)境內(nèi)毒素的反應(yīng)性，而不是高度純化的脂多糖標(biāo)準(zhǔn)品。藥典LAL測(cè)試與任何重組替代品之間的差異必須科學(xué)解決。與1980年代初期采用LAL測(cè)試類(lèi)似，LAL不是單一酶，LAL不是三種酶，LAL確實(shí)包含三種蛋白酶酶原，已知它們與細(xì)菌內(nèi)毒素的順序激活有關(guān)。LAL還包含對(duì)β1-3葡聚糖敏感的G因子酶。LAL包含可溶性蛋白質(zhì)凝結(jié)原，可通過(guò)活化的凝血酶將其轉(zhuǎn)化為不溶性凝膠。LAL還包含三種絲氨酸蛋白酶抑制劑樣蛋白，可調(diào)節(jié)LAL內(nèi)毒素和葡聚糖激活級(jí)聯(lián)反應(yīng)。LAL包含抗LPS因子，可中和細(xì)菌內(nèi)毒素，抗微生物肽，α2-巨球蛋白，大防御素和胱抑素。LAL是鱟450萬(wàn)年原始的免疫系統(tǒng)，和人類(lèi)鱟將繼續(xù)作為針對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物注射藥物的有效且可靠的安全性測(cè)試。我們認(rèn)識(shí)到，人們對(duì)大西洋horse的種群可持續(xù)性存在擔(dān)憂(yōu)。

重組表達(dá)的C因子檢測(cè)方法

幸運(yùn)的是，能夠取代鱟試劑的檢測(cè)方法已經(jīng)問(wèn)世。Lonza科學(xué)家開(kāi)發(fā)了PyroGene™重組表達(dá)的C因子檢測(cè)方法。C因子是內(nèi)毒素激活的鱟凝固級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的第一個(gè)組成部分，只用于內(nèi)毒素檢測(cè)，是進(jìn)行內(nèi)毒素釋放測(cè)試的可靠替代方案。

LAL和重組C因子檢測(cè)的原理示意圖

重組C因子是一種化學(xué)合成的試劑，性狀更穩(wěn)定，均一性相對(duì)也更好。試劑價(jià)格目前和鱟試劑相當(dāng)，后期如在國(guó)內(nèi)外廣泛應(yīng)用起來(lái)，價(jià)格會(huì)比鱟試劑更具競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。

目前，F(xiàn)DA現(xiàn)已批準(zhǔn)重組C因子作為鱟試劑的替代方案，用于生物制品的放行和過(guò)程檢測(cè)。2020版中國(guó)藥典通則9301附錄里面也有關(guān)于重組C因子的檢測(cè)說(shuō)明，但是如需放行檢測(cè)，還需要做相關(guān)驗(yàn)證試驗(yàn)。

內(nèi)毒素檢測(cè)只是生物制劑質(zhì)量控制的冰山一角，然而這一角冰山卻足以毀滅一個(gè)物種。正如更多更好的藥物可以造福更多的人，對(duì)環(huán)境更友善的檢測(cè)方法也能造福更多的“小鱟小蝦”。