本研究基于多層次仿生策略，優化了半月板源性生物墨水的制備，使其兼顧可打印性和細胞相容性。另外設計了定制的打印系統，將人工材料和生物墨水的優勢很好的結合，進一步提高仿生水平。最后通過細胞活力、力學、生物降解和體內實驗等，確保該支架具有足夠的可行性和功能性，為其在組織工程中的應用提供可靠的依據。

01、研究內容簡介

通過3D生物打印制備仿生支架是治療受損半月板的有效方法。然而，由于半月板獨特的解剖結構和復雜的應力環境，許多研究都采用了多種技術來充分利用不同的材料，如單純3D打印，或與灌注結合，或與靜電紡絲結合，來追求半月板的仿生，但這使得制備過程在一定程度上復雜化。一些研究人員試圖僅通過3D生物成像來解決這一挑戰，但打印材料和模型受到了明顯的限制。本研究中基于多層仿生策略，優化了半月板源性生物墨水--甲基丙烯酸明膠(GelMA)/半月板細胞外基質(MECM)的制備，同時考慮其打印性和細胞相容性。隨后，設計了一個定制的3 d生物打印系統--雙噴嘴+ 多重溫度系統，將聚已酸內酯(PCL)和半月板纖維軟骨軟骨細胞(MFCs)嵌入的GelMA / MECM 生物墨水的優勢很好的結合，完成了仿生半月板支架的打印。最后通過細胞活力、力學、生物降解和體內組織形成等方面的研究，確保該支架具有足夠的可行性和功能性，為其在組織工程領域的應用提供可靠的依據。

Fig 1. Process of printing the biomimetic meniscal scaffold. The bioink was prepared by mixing ultrasonicated MECM, GelMA and MFCs at specific concentrations. Meanwhile, the sheep meniscus was scanned by CT, modeled in Mimics, and used to plan the printing path. The prepared bioink and PCL were printed under the designed printing parameters according to the established printing path, and finally, printing of the biomimetic meniscal scaffold was completed.

仿生半月板支架的打印經歷了一個復雜的過程（Fig 1）。良好的微環境有利于半月板組織的再生。因此制備兼顧可打印性和細胞相容性的生物墨水是十分關鍵的一步。當前用于生物3D打印的生物墨水主要由天然聚合物組成，包括藻酸鈉，明膠，膠原蛋白，殼聚糖，纖維蛋白，透明質酸和ECM等 。其中，ECM保留了大多數天然成分，去除了細胞免疫原性，是一種理想的生物材料。但是，由于ECM的成分復雜，不溶于水和有機溶劑，因此，難以打印。本研究開發了超聲的方法，將ECM顆粒粒徑減小且均一化，實現了ECM的可打印性。另外，該方法能夠有效的調控材料的粒徑并保證較小的破壞（Fig 2）。該研究還引入了明膠衍生物GelMA。兩種材料按照特定濃度混合制備了可打印性和細胞相容性兼顧的半月板來源生物墨水（Fig 3）。

Fig 2. Characterization of printable MECM. (a) Effect of ultrasonication time on the particle size of MECM. (b) Effect of treatment method on the particle size of MECM. (c) Quantitative distribution of the particle size. (d) Gross observation. (e) SEM images (scale bar: 1 μm). (f) Type I collagen immunofluorescence images (scale bar: 500 mm). (g) Quantitative analysis of the collagen concentration (**P < 0.01, ***P < 0.001).

Fig 3. Cytocompatibility of the meniscus-derived bioink. (a) CCK-8 assays results of MFCs cocultured with different hydrogels for 1-7 days. (b) Comparative gene expression analysis for chondrogenic SOX9, COL1A2 and COL2A1 in GelMA and GelMA/MECM at 14days. (c) Immunofluorescence images showing the chondrogenic phenotype of MFCs in GelMA and GelMA/MECM constructs by COL type I staining (Green), cell nuclei (DAPI, blue) and F-actin (Rhodamine-phalloidin, red) (scale bar: 500μm).

生物墨水的流變特性對于優化打印參數至關重要。本研究充分表征了GelMA / MECM的流變學特性，發現該墨水具有良好的穩定性和一定的溫敏性（Fig 4）。此外，這項研究表明，GelMA / MECM對溫度較不敏感，具有明顯的延遲性，需要超過30分鐘才能達到穩定。由于在打印過程中組件之間的相互熱干擾，GelMA / MECM的粘彈性可能存在一些波動，這些波動可能會影響打印的平滑性和細胞的活力。因此，在這項研究中，選擇了電機驅動打印而非氣動驅動打印。這樣即使GelMA / MECM由于溫度波動而表現出一定的粘彈性變化，也不會明顯影響打印過程的平滑性。

Fig 4. Rheological characteristics and printability of the bioinks. (a-d) Rheological characteristics of the bioink: (a) Loss modulus (G’’) and storage modulus (G’) at different angular frequencies. (b) Variation in viscosity with varying shear rate at the gelation temperature. (c) Gelation kinetics from 15°C to 37°C. (d) Variations in loss modulus (G’’) and storage modulus (G’) from 37°C (T0) to a fixed temperature (T1, referring to legends). The above experiments were repeated in triplicate. GelMA/MECM’s transition of state from sol at 37°C (e) to gel at 20°C (f). (g) Printability of GelMA/MECM (scale bar: 1 cm). (h) GelMA/MECM hydrogel under a light microscope (scale bar: 1 mm). GelMA’s transition of state from sol at 37°C (i) to gel at 15°C (j). (k) Printability of GelMA (scale bar: 1 cm). (l) GelMA hydrogel under a light microscope (scale bar: 1 mm). (m) Spreading ratio of the bioinks (ns: P > 0.05).

多噴頭打印技術極大地擴展了可以選擇的材料范圍，這有利于構建復雜的3D模型。但是，不同噴嘴和不同材料的配合仍然涉及許多細節。因此，探索每種材料的打印條件是必要的（Fig 5）。關于載有細胞的水凝膠的打印，生物墨水和細胞的類型均會對細胞活力造成一定的影響。在這項研究中，為確保高形狀保真度和細胞活力（大于90％），需要反復調整包括GelMA / MECM濃度比，噴嘴的內徑，打印溫度和打印速度在內的各種參數。PCL的打印相對簡單，要點僅包括打印溫度和速度。這項研究中的最大挑戰是如何很好地協調兩個噴嘴和材料，以同時兼顧結構穩定性，細胞活力和所需的機械性能等。經過反復試驗，最終確定以85°C為最佳PCL打印溫度，并根據凝膠動力學確定了20°C的水凝膠打印溫度。打印平臺溫度為20°C也是重要的條件，有助于防止GelMA / MECM凝膠由于交聯前相對較高的室溫而轉變成溶液。否則，可能會破壞物質交換孔隙的形成。實際上，要解決整個過程中的關鍵問題，需要對材料和打印原理有充分的了解，并且這樣的了解將有利于在不同領域中順利創建多種定制模型。

Fig 5. Development of the biomimetic meniscal scaffold system. The primary model(a-d): the gross observations (a) (scale bar:1 cm), the microscopic images (b) (scale bar: 1 cm) and SEM images (c, d) (scale bar: 500 um) of the hydrogel scaffold ("GelMA/MECM" hydrogel, abbreviated as "hydrogel" in subsequent experiments), PCL scaffold and simple square scaffold from left to right. (e) Process of printing the biomimetic meniscal scaffold. (f) Specific details of the meniscal model. (g) Actual diameter of the strands of the meniscal scaffold.

細胞活力和機械性能是用于驗證該打印模型成功與否的初步標準。許多因素，包括生物墨水成分以及打印模型和參數，都會影響打印過程中的細胞活力。在本研究中，使用單噴嘴和雙噴嘴打印進行細胞活力測試，然后在體外培養1天和14天。細胞活力超過90％（Fig 6）。此外，將水凝膠培養長達6周，細胞活力保持在90％以上。這些數據證明了該打印模型的可行性以及生物墨水的良好細胞相容性。

Fig 6. Cell viability after printing with a single nozzle (hydrogel+MFCs) and dual nozzles (PCL+hydrogel+MFCs). (a) Confocal images of two constructs after live-dead staining at two time points (scale bar: 500μm). The panoramic scanning (4×4) of the constructs printed by a single nozzle (b, black part was hole) and dualnozzles (c, black part was PCL) at 1 day (scale bar: 1mm). (d) Quantitative results for cell viability (*P < 0.05, ns: P > 0.05).

關于力學性能，本研究通過增加PCL單絲間距并減小PCL單絲直徑以實現更好的力學仿生。最終，PCL單絲直徑設置為500μm，間距設置為1000μm。支架的壓縮模量為12.63 MPa，高于人類半月板的壓縮模量（0.3–2 MPa）（Fig 7）。此外，受整體模型的限制，拉伸模量為24.86 MPa，在徑向方向上接近半月板的拉伸模量（4-20 MPa）。但是，與周向拉伸模量（78-120 MPa）相比，仍然存在一定差異。而這種差異只能通過開發更合適的材料去解決。

Fig 7. Mechanical properties of the scaffolds printed by single nozzle and dual-nozzle. (a) Compressive stress-strain curve. (b) Compressive Young's modulus (**P < 0.01). (c) Tensile stress-strain curve. (d) Tensile Young's modulus (**P < 0.01).

缺損組織再生和支架降解之間的匹配對于支架在組織工程領域的應用十分重要。而本研究所用的材料在降解時間上存在一定的差異，因此研究者對不同的支架成分進行了針對性的實驗設計。隨著熒光成像技術的發展，可以以無創方式在體內連續監測水凝膠的變化，為評估水凝膠的生物降解提供了一種有效而可靠的方法。因此，首先研究者將嵌入細胞的水凝膠支架培養長達八周，以驗證其基本穩定性。然后，在原位植入支架以評估PCL的生物降解，并在小鼠皮下植入Cy7標記的支架以通過體內成像監測水凝膠的降解。結果表明，支架中水凝膠的生物降解需要大約一個月的時間（Fig 8）。關于支架的原位降解，一些支架在3個月時開始出現損傷，而在6個月時僅可見這些支架的殘骸。原因在分子量和納米壓痕測試的結果中（Fig 9）得到了很好的解釋。支架的分子量在3個月時沒有顯著降低，但在6個月時有一定的降低，納米壓痕的測試也呈現出了類似的結果。這表明最初的微環境可能對支架的完整性影響很小，但隨著時間的延長和分子量的降低，支架的強度逐漸減弱，從而大部分發生了降解。該結果表明，半月板的機械環境可能對支架的降解發揮了重要作用。

Fig 8. Quantitative fluorescence analysis of subcutaneous hydrogel degradation. (a) Variation in the fluorescence intensity of all specimens. The specimens in green circle cultured in PBS as control group. (b) Quantitative fluorescence analysis of three subcutaneous specimens from each group. (c) The process of surgical operation. (d) Dissection of the samples’ position after the fluorescence disappearance.

Fig 9. Analysis of the biodegradation of scaffolds in situ. (a) Gross view of the implant and femoral condyles (scale bar: 1 cm)，with the implants location shown in red circles . (b) Variation in the molecular weight of PCL. (c) Variation in the elastic modulus of PCL (****P < 0.0001). (d) Variation in the hardness of PCL (***P < 0.001). (e) Histological evaluation by collagen type I immunohistochemistry and picrosirius red (PR) and toluidine blue (TB) staining (scale bar: 500 mm).

裸鼠模型是觀察組織工程軟骨在體內形成的主要方法。無胸腺裸鼠的免疫系統降低，允許異種細胞的植入。因此，在本研究中，嵌入細胞的支架被植入裸鼠皮下，以分析纖維軟骨組織的形成。結果表明，GelMA/MECM水凝膠和MFCs協助了類半月板組織的形成(Fig 10)。然而，由于裸鼠皮下微環境與人體半月板原生微環境存在明顯差異，該支架還需要在大型動物實驗中進行驗證。

Fig 10. Preliminary evaluation of the regenerative effect of scaffolds in a nude mouse model (scale bar: 500 mm).

總體來說，本研究通過一個定制的雙噴頭 + 多重溫控打印系統和半月板源性的生物墨水，充分集中了PCL和GelMA / MECM / MFCs的優勢，實現類似于半月板的形態、力學、組分和微環境。并進行了各種針對性的驗證，以確保該支架在組織工程領域中應用的可行性和有效性。然而，該支架在某些方面仍與天然半月板不同。PCL硬度高和柔韌性不足。MECM在脫細胞后失去其原始的物理性能，僅通過材料的逐層堆疊才能實現部分仿生，這與高度交聯的半月板膠原纖維的環狀排列不同。因此，材料科學和打印技術的改進可能是推動組織工程學發展的關鍵。當前，不同技術的結合對于實現半月板的更高水平的仿生品可能是有效的。

02、論文第一/通訊作者簡介

第一作者

周建：碩士，中國人民解放軍總醫院第四臨床醫學中心骨科研究所，研究方向為3D生物打印，半月板組織工程。

田壯：碩士，中國人民解放軍總醫院第四臨床醫學中心骨科研究所，研究方向為3D生物打印，半月板組織工程。

通訊作者

郭全義：主任醫師/教授/博導，中國人民解放軍總醫院第四醫學中心骨科研究所負責人。“十二五、十三五、十四五”及科技部“863”生物醫藥領域組織工程關鍵技術與系列產品研發主題項目首席專家。首屆中華醫學會再生醫學分會副主任委員，中國醫藥技術協會骨組織庫分會副主任委員，針對骨關節炎、關節退變、關節軟骨損傷、股骨頭壞死、骨科腫瘤等影響人類健康，難以醫治的疾病進行了科研和臨床研究，先后承擔和參加了國家自然基金面上項目、重點項目、國家科技部領域項目（領域首席科學家）、“863”課題、“973”項目、科技部支撐計劃、總后衛生部重點課題等攻關工作。先后發表國內外論文70余篇。多次參與可專業書籍的翻譯和編寫工作，在國際上首先把第四代組織工程軟骨應用于關節軟骨損傷的修復，為早期關節軟骨損傷的患者帶來了福音，將很大程度避免由于軟骨損傷導致的關節置換手術。

唐佩福：主任醫師/教授/博導，中國人民解放軍總醫院骨科分院院長，創傷病區行政主任。現任中國醫師協會骨科分會常委，華裔骨科學術委員會理事，骨與關節損傷學術委員會委員，全軍骨科學術委員會委員，中國致殘委員會常委，中國康復學術委員會常委，，《中華創傷雜志》通訊編委，《中華中西醫雜志》編委，《中華創傷骨科雜志》通訊編委，《實用骨科學》編委。曾獲得國家自然科學基金、北京市自然科學基金和軍隊十一五課題等多項基金資助。長期致力于創傷的臨床工作，并結合臨床進行定向科研攻關，專業發展方向主要以骨質疏松性骨折、骨折微創治療、髖臼骨折等治療為重點，同時在四肢創傷、戰傷救治、脊柱創傷、骨盆骨折、老年髖部損傷等領域進行了一系列研究。近三年來，以第一作者發表論文14篇，《EI》收錄2篇。唐佩福教授長期致力于骨創傷與軟組織損傷修復方面的基礎研究及手術治療方法的改進。在骨折治療的BO理念指導下，于國內率先開展了骨折微創治療的系列研究。由于術中不開放骨折端，不剝離骨膜，軟組織損傷程度更小，因此充分保護了骨折局部的生物環境，是一種全新理念指導下的生物接骨術。此外，還開展了系列老年骨質疏松癥的基礎研究，探討了調控成骨細胞與破骨細胞平衡的信號傳導系統，發現P57小體和PLAD域等重要的細胞膜結構和啟動基因，對老年骨質疏松癥的啟動和進展起到關鍵作用。

姚琦：主任醫師/教授/博導，國家公派哈佛大學麻省總醫院博士后，現任首都醫科大學附屬北京世紀壇醫院骨關節科主任、中華醫學會創傷分會青年委員會副主任委員，中華醫學會北京骨科分會委員、中華醫學會骨科分會創傷學組委員。長期致力于創傷骨科的臨床工作，并結合臨床進行科研攻關，專業發展方向主要以骨質疏松骨折、骨折微創治療及骨科智能機器人為重點。首次利用原核表達系統成功制備出Sclerostin 蛋白，在獲得分泌抗sost 單克隆抗體基礎上, 利用RT-PCR 技術擴增了抗體可變區基因VH和VL, 組裝成了單鏈抗體基因SOST-scFv, 并構建單鏈抗體原核表達載體SOST-scFv-22b, 對表達蛋白的活性進行初步研究, 為研究利用基因工程抗體治療骨質疏松性疾病奠定基礎。先后主持科技部重點研發計劃、國家自然科學基金、北京市自然科學基金等多項課題；以第一作者和通訊作者發表SCI文章20余篇，中文核心期刊論文20余篇；獲得國家發明專利3項，參與編寫《坎貝爾骨科手術學》。

03、資助信息

該研究得到了國家重點研發計劃（2017YFC1103404）國家自然科學基（81872070）等項目的支持。

04、原文信息

Jian Z, Zhuang T, Qinyu T, Liqing P, Kun L, Xujiang L, Diaodiao W, Zhen Y, Shuangpeng J, Xiang S, Jingxiang H, Shuyun L, Libo H, Peifu T, Qi Y, Quanyi G. 

3D bioprinting of a biomimetic meniscal scaffold for application in tissue engineering. 

Bioact Mater. 2020 Nov 30;6(6):1711-1726.