摘要  目的：建立果膠中果糖、半乳糖和半乳糖醛酸的薄層色譜鑒別方法。方法：以果糖、半乳糖和半乳糖醛酸為對(duì)照，采用硅膠G薄層板，以乙酸乙酯-冰醋酸-水(2∶1∶1)為展開(kāi)劑，噴以茴香醛溶液(取茴香醛0.5mL、冰醋酸10 mL、甲醇85 mL與硫酸5mL混合)顯色，在110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，可見(jiàn)光下檢視。結(jié)果：果膠薄層色譜鑒別方法斑點(diǎn)顯色清晰，分離度好，具專屬性。結(jié)論：新建的薄層方法可用于果膠的鑒別。

關(guān)鍵詞：果膠；半乳糖醛酸；薄層色譜鑒別

果膠是一種天然高分子化合物，廣泛存在于植物的初生細(xì)胞壁和胞間層，是一類以D-半乳糖醛酸由α-1.4-糖苷鍵連接組成的酸性雜多糖，除D-半乳糖醛酸外，還含有果糖、D-半乳糖等多達(dá)12種的單糖，其具有良好的膠凝化和乳化穩(wěn)定作用。膠凝性是果膠最重要的特性，在醫(yī)藥、食品等行業(yè)常利用果膠的凝膠性制備包埋藥物、風(fēng)味物質(zhì)等的產(chǎn)品。

果膠收載于《中華人民共和國(guó)藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國(guó)藥典》)2015版四部，其鑒別為理化反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顏色不明顯。相關(guān)文獻(xiàn)中有果膠的含量測(cè)定方法，包括高效液相色譜法、離子色譜法、比色法、原子吸收法等，果膠薄層色譜鑒別方法尚未發(fā)現(xiàn)。而薄層色譜法在中藥和中成藥的分析及鑒別中有較廣泛的引用，具有專屬性強(qiáng)的特點(diǎn)。本次實(shí)驗(yàn)研究果膠薄層色譜鑒別，提高其專屬性。

1  、儀器與試藥

1.1  儀器

賽多利斯CP225D電子天平(十萬(wàn)分之一)，LDZ5-2離心機(jī)(北京京立有限公司)，EYELAN-1200BV-WD旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(島津)。薄層板(Merch、煙臺(tái)化工廠)

1.2  試藥

果糖(批號(hào)：100231-201305)、半乳糖(；批號(hào)100226-201105),中國(guó)食品藥品檢定研究院；D-半乳糖醛酸(進(jìn)口，批號(hào)SHB170216)：樣品名稱(廠家A，批號(hào)：AP1174D/S17022111；廠家B，批號(hào)：AP1174D/S16101101；廠家C，批號(hào)：APA170/S17091504；廠家D，批號(hào)：APA105/S17081804；廠家E批號(hào)：2017241901；廠家F，批號(hào)5A-6；廠家G，批號(hào)：18170413A65-01；廠家H，批號(hào)：18170413B65-01；廠家I，批號(hào)18170413C65-01)；茴香醛(阿拉丁)、甲醇、乙酸乙酯等試劑均為分析純(由廣州化學(xué)試劑廠生產(chǎn))，水為純化水。

2 、 方法與結(jié)果

2.1  溶液的制備

2.1.1  對(duì)照品溶液

半乳糖對(duì)照品溶液：取半乳糖對(duì)照品10mg，加90%甲醇溶液5mL使溶解，即得。

半乳糖醛酸對(duì)照品溶液：取半乳糖醛酸對(duì)照品10mg，加90%甲醇溶液5mL使溶解，即得。

果糖對(duì)照品溶液：取果糖對(duì)照品10mg，加90%甲醇溶液5mL使溶解，即得。

混合對(duì)照品溶液：取半乳糖、半乳糖醛酸、果糖對(duì)照品各10mg，加90%甲醇溶液5mL使溶解，即得。

2.1.2  供試品溶液

取供試品0.1g，置離心管中，加三氟醋酸溶液(6.7→100)2mL，密塞，強(qiáng)力振搖使成凝膠狀，120 ℃下放置1 h。離心，取上清液置圓底燒瓶中，加水10 mL，60 ℃減壓蒸干。殘?jiān)?0%甲醇溶液2mL使溶解，濾過(guò)，即得。

2.2  薄層色譜法

薄層板為Merck硅膠G板，硅膠G預(yù)制薄層板(煙臺(tái)市化學(xué)工業(yè)研究所)展開(kāi)劑為乙酸乙酯-冰醋酸-水(2∶1∶1)展開(kāi)方式為上行展開(kāi)，二次展開(kāi)，每次展開(kāi)距離均約15 cm。點(diǎn)樣量為點(diǎn)狀點(diǎn)樣，點(diǎn)樣量為1 μL。

2.3  顯色與檢視

茴香醛溶液(取茴香醛0.5mL、冰醋酸10mL、甲醇85mL與硫酸5mL混合)，110 ℃加熱至斑點(diǎn)顯示清晰。

2.4  方法學(xué)考察

對(duì)薄層色譜鑒別方法進(jìn)行耐用性考察。考察不同溫度、濕度和不同薄層板等影響因素，確保方法的可靠性。

2.4.1  不同溫度的考察

取薄層板點(diǎn)樣，分別在4 ℃(a)和室溫26 ℃(b)下展開(kāi)顯色檢視。結(jié)果見(jiàn)圖1。結(jié)果表明：溫度的變化對(duì)該鑒別方法無(wú)明顯影響。

圖1  4℃(a)和26 ℃(b)果膠薄層色譜圖

1.半乳糖對(duì)照品(galactose reference substance)  2. 半乳糖醛酸對(duì)照品(galacturonicacid reference substance)  3.果糖對(duì)照品(fructose reference substance)  4. 混合對(duì)照(Mixedreference substance)  5. 5～8供試品：A、B、C、G

2.4.2  不同濕度的考察

取供試品溶液與對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下方法，在室溫條件下，分別在環(huán)境濕度相對(duì)濕度為32%(c)、80%(d)的條件下分別展開(kāi)，結(jié)果如圖2。結(jié)果表明，不同濕度的條件下，各斑點(diǎn)分離度均滿足要求，沒(méi)有顯著差異。

圖2  32%(c)和80%(d)的果膠薄層色譜圖

1.果糖對(duì)照品(fructose reference substance)  2.半乳糖對(duì)照品(galactosereference substance)  3.半乳糖醛酸對(duì)照品(galacturonic acid reference substance)  4.混合對(duì)照品(Mixedreference substance)  5.供試品A (sample solutions A)

2.4.3  不同品牌的薄層板考察

取本品，分別在預(yù)制硅膠G薄層板(煙臺(tái)化工廠)(圖3f)與德國(guó)默克硅膠G板(圖3e)的薄層板點(diǎn)樣，展開(kāi)，結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，德國(guó)默克硅膠G板上各主斑點(diǎn)分離度符合要求，故選用德國(guó)默克硅膠G板。

圖3  不同薄層板的果膠薄層色譜圖

1.半乳糖對(duì)照品(galactose reference substance)  2.半乳糖醛酸對(duì)照品(galacturonicacid reference substance)  3.果糖對(duì)照品(fructose reference substance)  4.混合對(duì)照品(Mixedreference substance)  5.供試品A (sample solutions A) 6.6～8 供試品D～F (sample solutions D～F)

2.5  供試品色譜圖

吸取供試品溶液和混合對(duì)照品溶液各1 μL，按“2.2”方法點(diǎn)于同一Merck硅膠G薄層板，結(jié)果見(jiàn)圖4。結(jié)果表明，此方法分離度好，可用于果膠鑒別。

圖4  果膠薄層色譜圖

1.果糖對(duì)照品(fructose reference substance)  2.半乳糖對(duì)照品(galactosereference substance)  3.半乳糖醛酸對(duì)照品(galacturonic acid reference substance)  4.混合對(duì)照品(Mixedreference substance)  5～13.供試品(A～I(xiàn)) (sample solutions A～I(xiàn))

3  、討論

在研究果膠的特征糖時(shí)，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)果膠中主要含有半乳糖醛酸、果糖和半乳糖等成分，由于阿拉伯膠中的特征糖為乳糖、阿拉伯糖和鼠李糖；西黃蓍膠的特征糖為半乳糖、阿拉伯糖和木糖，因此能區(qū)分阿拉伯膠和西黃蓍膠。故選擇半乳糖、半乳糖醛酸和果糖作為果膠的特征鑒別糖。

降解果膠的方法有很多，如酸水解法、酶解法、水浴加熱法。其中酸水解法和酶解法是常用方法。實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)酸水解法和酶解法對(duì)比，酶解法采用藥品中加入果膠酶和緩沖溶液，進(jìn)行提取，最終發(fā)現(xiàn)酶降解法試驗(yàn)結(jié)果斑點(diǎn)不清晰，斑點(diǎn)有拖尾現(xiàn)象，Rf值不理想，有干擾。而酸水解的提取方法更方便，斑點(diǎn)信息量更多，斑點(diǎn)更加明顯，故選用酸水解做為樣品處理方法。

薄層鑒別方法的研究時(shí)，考察三種不同的展開(kāi)劑組成及比例。參考了《中國(guó)藥典》2015版四部中阿拉伯膠和西黃蓍膠項(xiàng)下的薄層鑒別方法，采用了1.6%磷酸二氫鈉溶液-丁醇-丙酮(10∶40∶50)，但結(jié)果斑點(diǎn)不清晰，有拖尾現(xiàn)象，因此舍棄該展開(kāi)劑。由于鑒別目標(biāo)是糖類成份，經(jīng)查閱關(guān)于糖類的薄層色譜展開(kāi)系統(tǒng)，根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整得到展開(kāi)系統(tǒng)為正丁醇-甲酸-水(4∶2∶1)，乙酸乙酯-冰醋酸-水(2∶1∶1)。經(jīng)對(duì)比最終以乙酸乙酯-冰醋酸-水(2∶1∶1)作為展開(kāi)劑，斑點(diǎn)更明顯，各斑點(diǎn)之間的分離度符合要求。

本法還考察了不同的展開(kāi)方式，經(jīng)試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)1次展開(kāi)，對(duì)照品圖譜與供試品圖譜的分離度無(wú)法滿足要求，2次展開(kāi)后，對(duì)照品圖譜和供試品圖譜中選定的特征鑒別糖各斑點(diǎn)分離度滿足要求。

該方法專屬性強(qiáng)，分離度好，可用于果膠的鑒別。該鑒別方法已被《中國(guó)藥典》2020年版四部果膠品種正文收載。

參考文獻(xiàn)

[1]  MURALIKRISHNA G，THARANATHAN Ｒ N. Characterization of pectic polysaccharides from pulse husks[J]. Food Chem， 1994， 50(1)：87

[2]  孫元琳，湯堅(jiān).果膠類多糖的研究進(jìn)展[J]. 食品與機(jī)械，2004， 20(6)：6

[3]  李堅(jiān)斌，李辰，楊勇，等.果膠基載體材料胃靶向載藥微丸的制備及應(yīng)用[J].  食品研究與開(kāi)發(fā)，2016， 37(10)：15

[4]  張雪嬌，劉春葉，楊莉?qū)?果膠含量測(cè)定方法研究現(xiàn)狀[J]. 應(yīng)用化工，2015， 44(4)：729

[5]  佘世科，葛少林，陳剛，等.不同前處理方法對(duì)豆腐柴葉中果膠含量檢測(cè)結(jié)果的影響[J]. 糧油食品科技，2014，22(5)：76

[6]  MOHNEN D. Pectin structure and biosynthesis[J]. Curr Opin Plant Biol，2008， 3(6)：266

[7]  ELST K，BABBAR N， ROY SV， et al. Continuous production of pectic oligosaccharides from sugar beet pulp in a cross flow continuous enzymemembrane reactor[J]. Bioprocess Biosyst Eng，2018， 41(11)：1

[8]  MANDALARI G，BENNETT R N， KIRBY A R， et al. Enzymatic hydrolysis off lavonoids and pectic oligosaccharides from bergamot（Citrus bergamia Risso) peel[J]. JAgric Food Chem， 2006， 54(21)：8307

[9]  HAO M，YUAN X， CHENG H， et al. Comparative studies on theantitumor activities of high temperature- and pH-modified citruspectins[J].  Food Function， 2013，4(6)：960

[10]  KHNELS， HINZ S W A， POUVREAU L， et al. Chrysosporium lucknowense arabinohydrolases effectively degrade sugar beet arabinan[J]. Bioresour Technol， 2010，101(21)：8300

[11]  ZHANG H，ZHOU X， XU Y， et al. Production of xylooligosaccharides from waste xylan，obtained from viscose fiber processing，by selective hydrolysis using concentrated acetic acid[J]. J Wood Chem Technol， 2017，37(1)：1

[12]  MARTíNEZM， GULLN B，SCHOLS H A， et al. Assessment of the production of oligomeric compounds from sugar beet pulp[J].  Ind Eng Chem Res， 2009，48(10)：4681

[13]  WU X，HUANG C， ZHAI S， et al. Improving enzymatic hydrolysis efficiency of wheat straw through sequential autohydrolysis and alkalinepost-extraction[J]. Bioresour Technol，2017， 12(66)：251，374[14]  劉秀花，王莉，張淑紅，等.玉米芯降解液糖類成分薄層色譜法分析技術(shù)優(yōu)化[J].  商丘師范學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30(9)：55

[15]  錢夕惠.薄層色譜法分析靈芝多糖中的單糖組成[J]. 中國(guó)現(xiàn)代藥物應(yīng)用， 2013，18(34)：13