本研究首次報道了基于人工合成受體可選擇性捕獲及釋放腫瘤細胞的唾液酸印跡溫度響應性水凝膠界面。該智能水凝膠表面不僅可以通過識別腫瘤表面過表達的唾液酸分子實現有效捕獲真實血液中的腫瘤細胞，還可以通過降低溫度消除識別位點的方式來無損釋放捕獲的細胞。與傳統非生理兼容性的細胞捕獲與釋放，該材料其具有非侵入性的外部刺激響應性，更高的捕獲釋放效率、細胞選擇性及穩定性，對基于細胞的癌癥診斷具有很大的應用前景。

01、研究內容簡介

分子識別介導的各種細胞進程是生理學和病理學的中心。然而，天然分子識別系統，如受體-配體或抗原-抗體相互作用，除了物理化學性質不穩定和不易儲存外，它們的分離和純化通常費時且成本較高。分子印跡技術（Molecular imprinting technology, MIT）制備的人工受體可模仿細胞過程中發生的自然分子識別，并能觸發選擇性細胞識別。唾液酸（Sialic acid, SA）是細胞膜蛋白或脂質聚糖中的關鍵成分，腫瘤細胞表面過度表達的SA殘基提供了通過定制具有特定SA識別的MIP來產生細胞親和力的方法。本工作提出的具有SA識別能力的印跡水凝膠，將MIT從簡單的分子分離提取應用拓展大到選擇性細胞分離，并通過引入熱響應性poly(N-Isopropylacrylamide) (PNIPAAm) 作為水凝膠骨架，實現選擇性捕獲及無損釋放腫瘤細胞（Fig.1），展現了MIT在醫學診療的潛力。

Fig. 1. Thermo-responsive SA-imprinted hydrogel layer enables selective capture and release of cancer cells (e.g., HepG-2, human liver carcinoma cells) through surface molecular specificity towards the overexpressed SA on the glycan terminal of cell membrane proteins.

該工作利用“三明治”結構法，在石英片表面制備了一層微米級別的SA印跡水凝膠（Sialic acid-imprinted hydrogel, SIH），此外還制備了對應的非印跡水凝膠NIH（Non-imprinted hydrogel）。由于SIH表面含有可特異性識別腫瘤細胞表面SA殘基的選擇性印跡空腔，因此可用于特異性捕獲過度表達SA的腫瘤細胞（Fig. 2）。

Fig. 2. Strategy to create SA-imprinted sites (i.e., SA-recognition) on thermo-responsive hydrogel layer by means of molecular imprinting on quartz substrate.

文章首先接著通過測試SIH和NIH的SA重新結合特性來確定其印跡機制。在測試濃度范圍內，SIH水凝膠可結合的SA比相應的NIH多（Fig. 3A）。進一步的等溫吸附實驗表明，在一系列的SA濃度范圍內，與NIH相比，SIH顯示出顯著更高的SA結合能力（Fig. 3B,C）。由于這些基于PNIPAAm的水凝膠具有溫度敏感的的表面潤濕性和內部結構變化特性，文章進一步考察了它的溫度響應性SA識別能力。在37 oC下，SIH水凝膠的SA結合能力比NIH水凝膠高2.4倍。當溫度降低到25 oC時，SIH和NIH的SA結合力均顯著降低，并且SIH的降低幅度遠大于NIH。此外，在25 oC時，SIH和NIH之間的結合能力無顯著性差異，證明得到的SIH具有溫度響應性SA識別能力（Fig. 3D）。

Fig. 3.  (A) Equilibrium bindings of SA in PBS (10 μg/mL) on different amount of SIH or NIH. (B) Binding isotherms of SA onto SIH or NIH (24 mg/mL) in PBS over a SA concentration range of 0–40 μg/mL. (C) Scatchard analysis of the binding isotherms. (D) Thermo-responsiveness of the binding capacity.

文章隨后研究了SIH和NIH對模型腫瘤細胞HepG-2的捕獲和釋放特性。HepG-2是膜表面過度表達的一類肝癌細胞。研究發現，SIH和NIH上捕獲的HepG-2細胞數量均呈時間依賴性，同時發現具有SA印跡位點的SIH能夠捕獲大量細胞，與NIH上的細胞數量對比明顯更多（Fig. 4 A-B）。由于SIH中的SA識別位點具有溫敏性，即SIH表面在低溫（例如25 oC）下會失去其SA結合能力，因此在降低體系溫度后，30分鐘內可以觀察到細胞從SIH表面快速脫離（Fig. 4 C-E）。這種現象表明具有溫度響應性SA結合能力的SIH水凝膠層可以有效捕獲SA過度表達的腫瘤細胞，并能通過生理可接受的溫度轉變方法快速釋放它們。這一高捕獲效率和快速釋放速率的結果表明，基于MIT的溫敏性智能平臺在選擇性收集腫瘤細胞方面的潛力。

Fig. 4. Cancer cell capture and release. (A) Time-dependent cell capture by the SIH and NIH hydrogel layer (HepG-2 cell, DiO-pre-staining, green). (B) The numbers of captured HepG-2 at different time intervals. (C) Temperature-induced cell release. (D) Cell release efficiency. (E) Details of the captured cells during the capture and release process.

作者還考察了在一個捕獲/釋放周期后，所收集得到的細胞的活性變化，因為這是后期細胞分析腫瘤精確診斷的關鍵。作者將回收得到HepG-2細胞重新培養，發現它們可以重新粘附在培養板上，并且發現其細胞生長行為與未經處理的原始細胞相當（Fig. 5A）。活死細胞染色結果也表明，回收的腫瘤細胞不受溫度轉變過程的負面影響。原始細胞和回收細胞并無顯著性活性差異（Fig. 5 B-C）。這進一步證實了用于細胞捕獲和分離的熱響應水凝膠層的非侵入性以及高度的生物相容性。

Fig. 5. The biocompatibility of thermo-responsive cell harvesting process. (A) The proliferation profiles of the original and recovered HepG-2 cells in 5 days. (B) The fluorescent images of HepG-2 cell after live/dead staining. (C) Quantitative result of live/dead cell-staining assay.

該工作進一步在SA過度表達的HepG-2細胞和正常小鼠成纖維細胞L929細胞的細胞混合物中進行選擇捕獲。在捕獲/釋放過程的一個周期之后，細胞混合物中HepG-2細胞數量的顯著增加（Fig. 6A）。HepG-2細胞的純度從32.5％提高到89.6％，最終可以回收超過40％的初始HepG-2細胞（Fig. 6B）。此外，以小鼠全血作為替代物，模擬癌癥患者含有循環腫瘤細胞（Circulating tumor cells, CTCs）的血液。實驗表明，該智能捕獲平臺表面可從人工CTCs血液樣本中捕獲超過15％的摻入的HepG-2細胞，表現出可觀的選擇性癌細胞捕獲效率（Fig. 6 C-D）。值得一提的是，通過降低溫度，所有結合的腫瘤細胞都可從SIH表面釋放出來，展現出簡便高效的細胞回收過程。

Fig. 6 (A) and (B) Selective cancer cell capture. (A) The fluorescent images of cell mixture of HepG-2 cells (green, DiO) and L929 cells (red, Dil) before (left) and after (right) on capture/release cycle. (C) Enumeration of the captured HepG-2 cells from artificial CTC blood sample spiked with 200 HepG-2 cells per mL. (D) The numbers of captured HepG-2 cells in three parallel trials.

總的來說，該工作基于人工合成受體的分子識別作用，設計出可逆識別腫瘤標記物SA的智能表面。該智能平臺具有溫度響應性的腫瘤細胞識別能力，可通過改變溫度來選擇性捕獲和釋放SA過表達的腫瘤細胞（例如HepG-2）。可以預期，這種基于MIT的可以分子識別平臺可成為一類檢測和收集CTCs乃至其他特異性細胞的的有用且通用的工具，具有很好的生物醫學應用前景。

原文信息

Yue Ma, Yimei Yin, Li Ni, Haohan Miao, Yingjia Wang, Cheng Pan, Xiaohua Tian, Jianming Pan, Tianyan You, Bin Li**, Guoqing Pan*. 

Thermo-responsive imprinted hydrogel with switchable sialic acid recognition for selective cancer cell isolation from blood. 

Bioactive Materials 6 (2021) 1308–1317.