在藥品生產、質量保證 (QA) 和質量控制 (QC)過程中，分析測試方法必須遵守國際標準。采用UV/Vis分光光度法進行蛋白定量，是目前最常用的蛋白藥物定量方法之一，基本所有制藥企業的QC都有不止一套UV/Vis光譜儀/分光光度計，也都非常關注數據合規性，但關于紫外吸收蛋白定量數據準確性驗證方法、影響數據準確性的因素 ，以及對正在“服役”的分析儀器是否符合藥典性能驗證要求，如何驗證等問題，相信很多人仍是一頭霧水。針對UV/Vis光譜儀作為分析工具的適用性驗證，美國藥典（USP）42<857>章節和歐洲藥典（Ph.Eur.）第2.2.2.25節規定了性能測試方案和驗證標準。本文我們就來條分縷析解讀藥典要求。

首先要清楚，USP 42<857> 和 Ph.Eur.2.2.2.25規定，應對UV/Vis分光光度計在預期用途操作范圍內進行吸光度準確性、精確性、線性、波長準確性、分辨率和雜散光驗證。然后我們再來解決一堆Why, What, How？

1. 吸光度準確性(absorbance accuracy)

用吸光度值經過認證的標準品 ，對吸光度準確性進行驗證，USP要求在0-2A之內，至少驗證1個吸光度值；而Ph.Eur.要求對預期吸光度范圍上下限值均需驗證，可接受偏差應該包含標準品生產不確定性偏差。

2. 吸光度精確性(absorbance precision)

Ph.Eur.第10版第2.2.2.25節對吸光度精確性無要求。USP 42<857>規定，如果標準值小于1A，則6次重復測定值的標準偏差（SD）應等于或小于0.005 A。如果其大于或等于1A，則6次重復的相對標準偏差（RSD）必須小于或等于0.5%

3. 吸光度線性(absorbance linearity)

為滿足USP 42<857>的吸光度線性標準，線性吸光度范圍內的3個具有不同吸光度水平的CRMs（認證標準物質）必須全部通過準確性和精確性測試。Ph.Eur.第10版第2.2.2.25節關于吸光度線性標準要求2個吸光度水平并且決定系數（R2）大于0.999。

根據USP 42<857>和Ph.Eur.2.2.2.25要求，需使用同一套CRMs對吸光度準確性、精確性和線性進行驗證，重鉻酸鉀（K2Cr2O7）高氯酸（HClO4）溶液是USP和Ph.Eu.推薦的200–400 nm波長范圍內UV/Vis分光光度計吸光度性能驗證標準品。

UV/Vis分光光度計測定樣品在紫外和可見光范圍內多波長吸光度，USP和Ph.Eur.規定所有UV/Vis分光光度計，必須驗證波長準確性和分辨率。

4. 波長準確性(Wavelength accuracy)

UV/Vis分光光度計的波長準確性是檢測儀器報告的波長與認證波長之間的相近程度，可通過測量具有多波長明確峰值且可追溯的CRM吸收光譜，將測量光譜與已知光譜進行比較來確定。

氧化鈥高氯酸溶液是一種國際公認的固有波長標準溶液，其吸收峰值在241、287、361、537和641 nm，在USP 42<857>和第10版Ph.Eur. 第2.2.2.25條中均有認定。根據USP和Ph.Eur.指南，200–400 nm之間波長驗證標準為偏差在1 nm以內，如果驗證波長>400 nm，則偏差在2 nm以內。

5. 波長分辨率(Spectral resolution)

光譜分辨率是指UV/Vis分光光度計正確區分吸收光譜中兩個相近波長吸光度的能力，可通過測量甲苯己烷溶液的吸收光譜，并確定最大吸光度（約269 nm）和最小吸光度（約266 nm）之間的比值考察。根據USP和Ph.Eur.標準，該比值不小于1.3。非廣告提醒：Big Lunatic每次測量前都會進行波長自動校準，所以可以確保良好的波長準確性和分辨率。

6. 雜散光（Stray light）

雜散光是指由UV/Vis檢測器檢測到的不屬于指定波長的、“來路不明”的光，主要來源為內部鏡面反射和二次衍射。雜散光在紫外波段的影響最大，而紫外波段也正是核酸和蛋白質定量的最重要范圍。因此USP和Ph.Eur.要求，UV/Vis分光光度計必須確定其雜散光限值。USP推薦采用丙酮對250-330nm波長范圍進行雜散檢測。Ph.Eur.指定使用碘化鈉、碘化鉀或亞硝酸鈉溶液來測試雜散光，但也允許其他標準物質。由于Ph.Eur.指定的標準溶液并不覆蓋核酸和蛋白最大吸收峰（分別為260和280nm），因此丙酮作為雜散光檢測參照物更合適。丙酮吸收250-330nm的大部分光，因此，通過UV/Vis分光光度計測量的該范圍內的任何光都可能是雜散光。USP驗證標準為吸光度大于或等于2A，而Ph.Eur.標準則要求吸光度≥3A(大于3A的吸光度相當于小于0.1%的雜散光)。