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藥物中硫酸二烷基酯類基因毒雜質(zhì)的檢測方法

嘉峪檢測網(wǎng) 2020-05-13 11:12

概述

硫酸二烷基酯類化合物（結(jié)構(gòu)見圖1）是醫(yī)藥行業(yè)中常見的烷基化試劑，例如硫酸二甲酯（DMS）常被應(yīng)用于藥物合成過程中的O-甲基化、S-甲基化、N-甲基化、芳香甲基化、胺轉(zhuǎn)化等反應(yīng)，典型案例有多巴胺受體激動劑羅替戈汀的第一步合成中，2,3-二羥基萘被硫酸二甲酯O-甲基化形成甲基醚；用于高血壓治療的血管緊張素II受體拮抗劑替米沙坦合成時，使用硫酸二甲酯將鄰硝基苯胺甲基化；非甾體抗炎藥羅非昔布合成工藝中，在氫氧化鈉存在下用硫酸二甲酯處理1-（4-巰基苯基）乙酮以形成4-甲硫基苯乙酮。硫酸二烷基酯類化合物也常常在藥品生產(chǎn)工藝中作為反應(yīng)副產(chǎn)物出現(xiàn)，例如調(diào)血脂的藥物依折麥布的合成過程中用到硫酸和異丙醇，兩者易發(fā)生反應(yīng)生成硫酸二異丙酯；氟喹諾酮類廣譜抗菌劑恩諾沙星合成工藝中存在的濃硫酸和甲醇經(jīng)化學(xué)反應(yīng)有可能形成硫酸二甲酯；治療骨關(guān)節(jié)炎和風濕性關(guān)節(jié)炎藥物塞來昔布以三氟乙酸和乙醇為起始原料，在濃硫酸及高溫條件下反應(yīng)時具有生成硫酸二乙酯的可能性，因此需要對其進行嚴格控制。

藥物中硫酸二烷基酯類基因毒雜質(zhì)的檢測方法

圖1.硫酸二烷基酯類化合物結(jié)構(gòu)圖

硫酸二烷基酯類化合物是已知的具有致癌致畸作用的試劑，其可通過對核酸鹽烷基化并引起遺傳性基因損害和染色體突變，歐盟在2012年12月將硫酸二甲酯（DMS）和硫酸二乙酯（DES）列入第八批需授權(quán)物質(zhì)（SVHC）候選清單，國際癌癥研究中心（IARC）也已經(jīng)將硫酸二甲酯列為2A類致癌物。因此，建立快速、靈敏、準確、可靠的硫酸二烷基酯類化合物分析方法，從而嚴格控制藥物和醫(yī)藥中間體中硫酸二烷基酯類化合物的含量是非常必要的。

根據(jù)參考各國藥典及文獻，總結(jié)了部分含有硫酸二烷基酯類基因毒雜質(zhì)藥物的種類，詳見表1。

藥物中硫酸二烷基酯類基因毒雜質(zhì)的檢測方法

表1. 含有硫酸二烷基酯類基因毒雜質(zhì)藥物列表

常用的檢測方法

直接檢測法：

目前硫酸二烷基酯類化合物檢測方法較多，大多采用常規(guī)檢測方法，如離子色譜法（IC）、氣相色譜法（GC）、頂空氣相色譜法（HS-GC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（LC-MS）等。其中，氣相色譜法又分為氣相色譜火焰光度法（GC-FPD）和氣相色譜氫火焰離子化法（GC-FID）等。有文獻報道，采用GC法配置氫火焰離子化檢測器（FID），以氮氣為載氣，直接測定依折麥布原料藥中硫酸二異丙酯雜質(zhì)的殘留；采用GC-MS的方法，在選擇離子檢測掃描模式（SIM）下采集，直接測定恩諾沙星中基因毒性雜質(zhì)硫酸二甲酯的含量；也有文獻顯示，建立LC-MS/MS法，在電噴霧離子化（ESI），負離子模式下MRM 采集，測定藥物左舒必利及起始原料中硫酸二甲酯的殘留量。值得注意的是，文獻報道的DMS大多采用GC或GC-MS法測定，但是DMS穩(wěn)定性較差，氣化溫度較高時，DMS會部分分解為甲醇，色譜圖中出現(xiàn)兩個峰，因此采用氣相方法時溫度需嚴格控制，避免影響方法的準確度和精密度。

衍生化法：

由于硫酸二烷基酯類化合物的氣相檢測方法在某些條件方面要求較為嚴格，為了滿足分析方法的要求，也為了提高硫酸二烷基酯類化合物的檢測靈敏度，可以選擇柱前衍生的方法進行檢測。比如國標法用對硝基苯酚作衍生試劑，將DMS衍生化成對硝基茴香醚，再用紫外檢測器檢測；也有文獻報道將DMS衍生化成N-甲基吡啶，質(zhì)譜檢測器正離子模式檢測，或者衍生成N-甲基苯胺，火焰離子化器（FID）直接進樣檢測。藥物中硫酸二烷基酯類基因毒性雜質(zhì)衍生化法檢測的實際應(yīng)用也很常見，比如衍生后頂空氣相法測定塞來昔布中硫酸二乙酯的殘留，該法采用碘化鈉作為衍生化試劑，將DES衍生成碘甲烷后頂空進樣，電子捕獲檢測器測定其含量。

案例

塞來昔布：

塞來昔布（Celecoxib，化合物1，圖2），化學(xué)名為4-［5-(4-甲苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基］苯磺酰胺，為特異性的COX-2 抑制劑，臨床上主要用于治療骨關(guān)節(jié)炎和風濕性關(guān)節(jié)炎。塞來昔布的合成工藝中以三氟乙酸和乙醇為起始原料在濃硫酸及高溫條件下反應(yīng)，生成三氟乙酸乙酯，再進一步反應(yīng)生成塞來昔布關(guān)鍵中間體和終產(chǎn)品。乙醇在濃硫酸和高溫條件下，具有潛在生成基因毒性雜質(zhì)硫酸二乙酯的可能性，因此應(yīng)嚴格控制其在塞來昔布及中間體中的限量。根據(jù)ICH，對于長期服用的藥物基因毒性雜質(zhì)的最大攝取量為1.5 μg/d，塞來昔布的最大日劑用量為600 mg，則對應(yīng)的基因毒性雜質(zhì)DES的限度為5 ppm。

藥物中硫酸二烷基酯類基因毒雜質(zhì)的檢測方法

圖2. 塞來昔布的合成工藝

因此，采用衍生后頂空進樣氣相色譜，電子捕獲檢測器測定塞來昔布中DES的含量。根據(jù)ICH指南的要求，對該方法進行了檢測限（LOD）、定量限（LOQ）、線性、精密度、準確性等相關(guān)驗證，DES在40~200ng/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9996，DES的LOD和LOQ分別能夠達到20 ng/mL及40 ng/mL ，平均回收率為90.37 %，RSD為5.38 %。本法靈敏、可靠、簡單且無機制干擾，適合在痕量水平下對塞來昔布中DES進行控制，為塞來昔布工藝過程控制和質(zhì)量保障提供參考依據(jù)。

美托洛爾:

美托洛爾（Metoprolol，化合物4，圖3），化學(xué)名為(±)-1-異丙氨基-3-[對-(2-甲氧乙基)苯氧基]-2-丙醇，為β受體拮抗劑，臨床用于治療各型高血壓(可與利尿藥和血管擴張劑合用)及心絞痛。美托洛爾的合成以對甲氧基乙基苯酚為起始原料，在氫氧化鈉作用下與環(huán)氧氯丙烷取代生成中間體5，再在異丙醇中與異丙胺開環(huán)加成得到1-異丙氨基-3-[對-(2-甲氧乙基)苯氧基]-2-丙醇，即美托洛爾。起始物料對甲氧基乙基苯酚的合成工藝中用到硫酸二甲酯作為甲基化試劑，硫酸二甲酯已被國際癌癥研究中心列為2A類致癌物，屬于已知致癌性的基因毒性雜質(zhì)，需要嚴格控制其在美托洛爾及其起始物料中的殘留量。

藥物中硫酸二烷基酯類基因毒雜質(zhì)的檢測方法

圖3. 美托洛爾合成工藝

因此，采用衍生后LC-MS或LC-MS/MS的方法測定對甲氧基乙基苯酚及美托洛爾中DMS的含量，即以吡啶為衍生化試劑，在乙腈溶液中將DMS衍生處理后經(jīng)HILIC分離和（+）ESI / MS（SIM）檢測。在該方法下，DMS的LOQ為0.06 μg/mL，在0.05~10 μg/mL的范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2 = 0.9965，回收率范圍101.0~113.8%。該方法快速、簡單、準確且經(jīng)全面驗證后符合檢測的需求。

總結(jié)

硫酸二烷基酯類化合物常被用作烷基化試劑或者反應(yīng)副產(chǎn)物存在于藥物合成過程中，這些物質(zhì)可能會殘留于終產(chǎn)品中成為雜質(zhì)，對人體器官如眼、上呼吸道產(chǎn)生強烈刺激作用，并損害肝、腎組織和心肌等，更因其致癌性和致畸變性導(dǎo)致癌癥和遺傳性基因損害的發(fā)生。因此，藥品中如果含有硫酸二烷基酯類化合物殘留，藥品就會存在質(zhì)量缺陷并對人類健康造成威脅，建立快速、靈敏、準確、可靠的分析方法以控制藥物中硫酸二烷基酯類化合物的含量在人類醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)展進程中顯得尤為重要。

基因毒性雜質(zhì)最主要的特點是在極低濃度時即可造成人體遺傳物質(zhì)的損傷，導(dǎo)致基因突變并促使腫瘤發(fā)生。因其毒性很強，對藥物的安全性造成強烈的威脅，行業(yè)中已多次出現(xiàn)由于基因毒性雜質(zhì)控制不合規(guī)，造成上市藥品強行被召回的案例，給企業(yè)造成了巨大的損失。因此，在個體對自身健康更為重視，審查機構(gòu)對藥品質(zhì)量合規(guī)性核查更為嚴格的今天，如何更好的運用QbD理念以控制藥品中基因毒性雜質(zhì)的含量并最大程度的降低成本，已成為當今企業(yè)的必修課之一。

本文根據(jù)以下文章進行編輯整理，僅用于學(xué)習、交流：.

1. Nelu Grinberg，F(xiàn)lorin Albu，Keith Fandrick，Elena Iorgulescu，Andrei Medvedovici, Assay at low ppm level of dimethylsulfate in starting materials for API synthesis using derivatization in ionicliquid media and LC–MS. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis (2013), 75, 1-6.

2. 汪生，倪悅泠，陸宇婷，宋敏，杭太俊，頂空氣相色譜法測定塞來昔布中硫酸二乙酯基因毒性雜質(zhì)，Chinese Journal of New Drugs (2018), 27 (20), 2437-2441.

3. 張耕，許兵，梅勇，柱前衍生氣相色譜法測定工作場所空氣中的硫酸二甲酯，Modern Preventive Medicine (2018), 45 (12) , 2137-2140.

4.Jianguo An，Mingjiang Sun，Lin Bai，Ted Chen，David Q. Liu，Alireza Kord，A practical derivatization LC/MS approach fordetermination of trace level alkyl sulfonates and dialkyl sulfates genotoxicimpurities in drug substances, Journal of Pharmaceutical and BiomedicalAnalysis (2008), 48, 1006–1010.

來源：諾衡分析

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