高效液相色譜是有機分析，特別是藥物分析的重要手段。而色譜峰峰形影響著化合物的定量和定性。在影響色譜峰峰形的諸多因素中，“溶劑效應”經常被忽視。本文是對高效液相色譜中“溶劑效應”的漫談，水平有限，歡迎批評指正。

高效液相色譜已經廣泛應用于有機分析，特別是藥物分析工作中。分析工作者通常將更多精力集中在流動相和儀器方法的選擇上，忽視了溶解樣品所用溶劑的重要性。高效液相色譜進樣之前，必須選擇一種合適的溶劑溶解樣品。如果溶劑選擇不當則會產生“溶劑效應”，使分析工作者在定性和定量分析中產生誤判，影響分析結果。因此，了解“溶劑效應”產生的原因及掌握避免“溶劑效應”的基本方法對分析工作者是十分必要的。

溶劑效應亦稱“溶劑化作用”。指液相反應中，溶劑的物理和化學性質影響反應平衡和反應速度的效應。可能造成色譜峰展寬、分叉、保留時間漂移、峰面積變化，雙峰等現象。與此同時，較早洗脫的峰出現前沿或分叉，較晚洗脫的峰峰形正常【1】。

樣品進入高效液相色譜中，當溶劑與流動相存在差異時，一部分樣品溶解進入了流動相，一部分還留在溶劑里,造成色譜保留的差異。造成這種差異的原因主要有以下幾個方面：

（1）溶劑強度

在反相色譜系統中溶劑強度的順序為水（最弱）＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜四氫呋喃＜丙醇＜二氯甲烷（最強）。溶解樣品的溶劑強度大于該樣品出峰時流動相強度，樣品溶劑可以看成流動相的一部分，一部分樣品溶解于溶劑中會被迅速洗脫出色譜柱，而一部分樣品溶解于流動相，被流動相洗脫出，這樣會造成色譜峰的展寬或者分叉^【2】。圖1是溶劑強度對色譜峰形的影響。

圖1  溶劑強度對色譜峰影響^[2]

圖2是筆者采用AgilentZORBAX TC-C18色譜柱以乙腈-水（30:70）為流動相，采用不同的溶劑對目標分析物進行處理制備同一濃度的溶液，考察目標分析物的峰面積及峰高。

圖2 不同溶劑溶劑效應對比

（2）進樣體積

進樣體積造成的溶劑效應是一般與溶劑種類有關的。流動相作為溶劑時，增加進樣體積后，目標分析物色譜峰不會發生遷移，保留時間基本穩定。使用強度大于該樣品出峰時流動相強度的溶劑，增加進樣體積后，目標分析物色譜峰會向前遷移，直至裂分，并且峰高變小峰寬變大。這是因為進樣體積較小時，擴散至流動相的目標分析物占絕大多數，除了保留時間略微提前，峰形以及峰寬與流動相溶解時基本一致。體積增大到一定程度，擴散至流動相氛圍的目標物與留在溶劑氛圍的目標物在數量上相當時，色譜峰分叉明顯。當樣品體積進一步增大，絕大多數目標物進入色譜柱時是溶解在溶劑中的，目標分析物的色譜峰已經明顯向前遷移了。

常規情況下，為了獲得良好的峰形，推薦的進樣量為10μL。不過實際情況中經常會出現20μL、30μL、50μL甚至100μL的進樣量，比如痕量物質的定量。所以如果不能減少至合適的進樣體積，為了獲得良好的響應和峰形，應盡量選擇與流動相比例相同或相近的溶劑。

圖3是某講義引入的進樣體積對峰形的影響。

（3）溶劑與流動相的兼容性

有些樣品采用流動相或者流動相中的有機相溶解難度較大，分析工作者會采用氯仿、乙酸乙酯、苯等溶劑，這些溶劑與流動相兼容性不佳，直接包裹溶質跳過色譜初期的保留過程，待溶劑的分配平衡建立起來后溶質過于展寬，甚至直接部分沖出色譜柱。^【3】其實在色譜柱中的流動相只有50%是動態，其余50%在死體積、載體間隙處于靜止狀態。溶質被固定相吸附先通過50%的“靜止區”，若溶劑及流動相不兼容，則影響溶質在溶劑與流動相之間的傳遞，從而影響被固定相吸附而導致峰形變差。

圖4是色譜保留機理圖^[5]

（4）溶劑pH值

易于解離的化合物對流動相的pH值較敏感。該化合物處理解離狀態下極性發生顯著變化，導致固液分配系數發生較大變化。該影響經常表現為保留時間的漂移而不是多個峰或者峰分叉等峰形差現象。

導致溶劑效應除了上述原因一般還有溶劑紫外吸收、柱前管路、柱長、離子締合、互變平衡等。再此就不做詳細敘述。

當出現色譜峰異常時，比如色譜峰分叉，可采用全波長掃描查看分叉色譜峰紫外吸收情況來進行判斷。另外對樣品溶液進行低樣本量（如0.5μL），若峰形正態基本就可以斷定為“溶劑效應”。

• 應該盡量使用流動相作為溶劑（梯度采用初始比例），可以極大減弱或消除溶劑對色譜行為的影響。溶劑中的有機相比例略低于流動相有機相比例時峰形更好。

• 當樣品濃度響應較大，可以采用減少進樣體積減弱溶劑的影響。但要酌情而定，比如在有關物質測定時，減少進樣量常常會犧牲靈敏度。

• 當溶劑因標準或者待測成分性質不能改變時，可適當調整流動相比例，使其強度盡量與溶劑接近，從而消除影響。

• 對于梯度洗脫而言，在不影響分離度的情況下，可以改用較粗內徑的柱前管路。

• 適當的對溶劑進行轉換（酸提、堿提、回流酯化或開環、衍生化等）。

• 適當的對溶劑進行凈化（固相萃取、固相分離萃取、液液萃取、GPC凈化等）

• 吸樣后，針不回針座，懸停空中，計量泵吸-排-吸-排數次，使目標物完全擴散至流動相。此條是同行相關經驗，并未經筆者驗證。

• 高純度：不能與固定相發生反應，溶劑不純會引起基線變差，產生“偽峰”。

• 溶劑應該與檢測器匹配，溶劑在紫外光條件下應沒有吸收或吸收很小。

• 溶劑對于待測樣品具備足夠的溶解能力。溶劑的極性要與待測樣品相匹配，如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉淀，不但影響純化分離，且會使柱子惡化。

• 溶劑化學穩定性良好，不與樣品發生聚合反應。

• 低粘度，沸點適中，減小溶質的傳質阻力，降低柱壓，利于提高柱效^【4】。常用的低粘度溶劑有丙酮、乙醇、乙腈等；粘度過低的溶劑也不宜采用，如戊烷、乙醚等，易在色譜柱或檢測器內形成氣泡，影響分離。 

以上是根據個人研究經驗結合相關資料總結的高效液相色譜使用中“溶劑效應”相關觀點，由于閱歷較淺，未盡全面。不足之處還請諒解！

參考文獻

【1】 Lee H K , Hoffman N E . INJECTION SOLVENT EFFECT ON PEAK HEIGHT IN ION-EXCHANGE HPLC[J]. Journal of Chromatographic Science, 1992,30(10):415-421.

【2】Hoffman N E , Chang J H Y . Injection Solvent Enhancement of Peak Height in Reversed-Phase Liquid Chromatography[J]. Journalof Liquid Chromatography, 1991, 14(4):651-658.

【3】謝孟峽, 楊力力.酚類化合物的反相高效液相色譜研究（I）[J].北京師范大學學報：自然科學版,1991(2):211-216.

【4】Castells C B , Castells R C . Peak distortion inreversed-phase liquid chromatography as a consequence of viscosity differences between sample solvent and mobile phase[J]. Journal of Chromatography A, 1998,805(1–2):55-61.

【5】溶劑對反相液相色譜中峰形的影響憶峰